摘要：研究發(fā)現(xiàn)缺氧誘導(dǎo)的環(huán)狀RNA hsa_circ_0065394編碼新型蛋白cPFKFB4強(qiáng)化糖酵解并驅(qū)動(dòng)腫瘤惡性進(jìn)展。
胰腺癌作為消化系統(tǒng)高度惡性的腫瘤，其五年生存率始終徘徊在10%左右，被稱為"癌中之王"。這種嚴(yán)峻的預(yù)后與腫瘤特有的缺氧微環(huán)境密切相關(guān)。在胰腺癌組織中，氧分壓可低至0-5.3 mmHg，遠(yuǎn)低于正常組織的9.3-92.7 mmHg。這種極度缺氧的狀態(tài)不僅幫助腫瘤細(xì)胞適應(yīng)惡劣環(huán)境，還驅(qū)動(dòng)了一系列惡性生物學(xué)行為，成為胰腺癌預(yù)后不良的獨(dú)立預(yù)測(cè)因素。
在缺氧微環(huán)境中，環(huán)狀RNA（circRNA）作為一類新型閉合環(huán)狀分子，通過反向剪接形成，其生物發(fā)生和功能與腫瘤缺氧微環(huán)境密切相關(guān)。研究表明，缺氧能誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生多種circRNA，這些分子幫助腫瘤細(xì)胞在缺氧條件下維持生存并促進(jìn)腫瘤進(jìn)展。然而，在胰腺癌中，缺氧相關(guān)circRNA編碼的蛋白質(zhì)功能仍不清楚。
研究人員將目光聚焦于PFKFB4基因——一個(gè)在糖代謝中發(fā)揮關(guān)鍵作用的酶。PFKFB4作為糖酵解分流酶，在果糖-2,6-二磷酸和果糖-6-磷酸的相互轉(zhuǎn)化中起核心作用，滿足腫瘤細(xì)胞的能量需求和氧化還原穩(wěn)態(tài)，從而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞在缺氧環(huán)境中的生存。基于此，研究團(tuán)隊(duì)提出科學(xué)假設(shè)：源自PFKFB4基因的circRNA可能是驅(qū)動(dòng)胰腺癌細(xì)胞適應(yīng)缺氧微環(huán)境并持續(xù)惡性演進(jìn)的關(guān)鍵分子。
為驗(yàn)證這一假設(shè)，研究人員采用缺氧培養(yǎng)系統(tǒng)篩選胰腺癌中缺氧響應(yīng)的circRNA，通過生物信息學(xué)分析和RNA免疫沉淀研究hsa_circ_0065394的環(huán)化機(jī)制，利用qRT-PCR和原位雜交評(píng)估其在胰腺癌中的表達(dá)譜和臨床意義。雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)、質(zhì)譜分析和Western blotting鑒定出hsa_circ_0065394編碼的蛋白cPFKFB4。通過功能獲得和缺失實(shí)驗(yàn)在體內(nèi)外驗(yàn)證cPFKFB4的生物學(xué)功能。從機(jī)制上，通過質(zhì)譜分析、免疫共沉淀、免疫熒光、PKM剪接檢測(cè)、RNA免疫沉淀、Western blotting和挽救實(shí)驗(yàn)，探索cPFKFB4如何調(diào)節(jié)hnRNP G與hnRNP A1的相互作用以及PKM選擇性剪接的調(diào)控。
研究發(fā)現(xiàn)缺氧相關(guān)的hsa_circ_0065394在胰腺癌組織中顯著上調(diào)，且與腫瘤大小密切相關(guān)。其生物環(huán)化由hnRNP L和Alu重復(fù)序列介導(dǎo)。機(jī)制上，hsa_circ_0065394通過非帽依賴機(jī)制編碼一個(gè)94個(gè)氨基酸的蛋白cPFKFB4。cPFKFB4通過特異性結(jié)合hnRNP G破壞hnRNP G-hnRNP A1復(fù)合物，促進(jìn)hnRNP A1介導(dǎo)的PKM選擇性剪接，從而增加PKM2的表達(dá)，進(jìn)而增強(qiáng)胰腺癌細(xì)胞的糖酵解，加速缺氧條件下胰腺癌的增殖和轉(zhuǎn)移。
圖1 由hsa_circ_0065394編碼的新型蛋白cPFKFB4通過增強(qiáng)PKM2介導(dǎo)的葡萄糖代謝重編程，促進(jìn)胰腺癌在缺氧條件下的進(jìn)展
關(guān)鍵技術(shù)方法
研究采用臨床樣本隊(duì)列（44對(duì)胰腺癌及癌旁組織）和腫瘤組織芯片（70例胰腺癌和58例正常組織），通過缺氧培養(yǎng)系統(tǒng)（1% O2）模擬腫瘤微環(huán)境。利用RNA酶R和放線菌素D實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證circRNA特性，雙熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)檢測(cè)IRES活性，質(zhì)譜分析鑒定蛋白質(zhì)相互作用，體內(nèi)外功能實(shí)驗(yàn)包括CCK-8、Transwell、裸鼠成瘤等評(píng)估生物學(xué)表型，PKM剪接實(shí)驗(yàn)和代謝檢測(cè)分析分子機(jī)制。
hsa_circ_0065394在缺氧胰腺癌細(xì)胞中的鑒定與表征
研究人員首先在缺氧條件下篩選PFKFB4來(lái)源的circRNA，發(fā)現(xiàn)hsa_circ_0065394在缺氧胰腺癌細(xì)胞中表達(dá)最顯著。Sanger測(cè)序證實(shí)該circRNA是由PFKFB4基因外顯子2、3、4通過頭尾剪接形成的281nt環(huán)狀RNA。
實(shí)驗(yàn)證實(shí)hsa_circ_0065394對(duì)RNA酶R具有抗性，且半衰期長(zhǎng)于線性mRNA，在細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)中均有分布，表明其是缺氧胰腺癌細(xì)胞中豐富且穩(wěn)定表達(dá)的circRNA。
hsa_circ_0065394的生物發(fā)生機(jī)制
通過生物信息學(xué)分析，研究人員在hsa_circ_0065394側(cè)翼內(nèi)含子中發(fā)現(xiàn)了高反向互補(bǔ)性的Alu重復(fù)序列（AluYc和AluSx1）。缺失突變實(shí)驗(yàn)證明只有同時(shí)存在這兩個(gè)Alu元件才能顯著上調(diào)hsa_circ_0065394表達(dá)。進(jìn)一步篩選發(fā)現(xiàn)hnRNP L是hsa_circ_0065394生物發(fā)生的關(guān)鍵調(diào)控因子。RNA免疫沉淀實(shí)驗(yàn)證實(shí)hnRNP L結(jié)合到PFKFB4前體mRNA的特定位點(diǎn)，促進(jìn)側(cè)翼內(nèi)含子互補(bǔ)重復(fù)元件的結(jié)合，從而加速hsa_circ_0065394的環(huán)化。
hsa_circ_0065394的表達(dá)特征與臨床意義
在胰腺癌細(xì)胞系中，hsa_circ_0065394表達(dá)顯著上調(diào)，尤其在PANC-1和PL45細(xì)胞中。臨床樣本分析顯示其在胰腺癌組織中明顯高表達(dá)，且與腫瘤大小顯著相關(guān)。
組織芯片和原位雜交結(jié)果進(jìn)一步驗(yàn)證了hsa_circ_0065394在胰腺癌組織中的高表達(dá)。生存分析顯示高表達(dá)患者總生存期更差，表明其具有重要的臨床預(yù)后價(jià)值。
hsa_circ_0065394編碼新型蛋白cPFKFB4
生物信息學(xué)預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)hsa_circ_0065394包含一個(gè)285nt的開放閱讀框（ORF）和內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)（IRES）。實(shí)驗(yàn)證實(shí)該circRNA可翻譯產(chǎn)生約25kDa的蛋白，命名為cPFKFB4。
雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)證明IRES序列具有啟動(dòng)翻譯活性，且完整的IRES序列對(duì)cPFKFB4的翻譯至關(guān)重要。
cPFKFB4通過hnRNP G調(diào)控PKM選擇性剪接
質(zhì)譜分析和免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)cPFKFB4與hnRNP G特異性相互作用。進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)確定cPFKFB4結(jié)合hnRNP G的SRGY和C-RBD結(jié)構(gòu)域。
研究發(fā)現(xiàn)hnRNP G通過C-RBD結(jié)構(gòu)域直接結(jié)合hnRNP A1，而cPFKFB4通過競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合hnRNP G的C-RBD結(jié)構(gòu)域，破壞hnRNP G-hnRNP A1復(fù)合物形成，從而增強(qiáng)hnRNP A1與PKM前體mRNA的結(jié)合。
PKM剪接實(shí)驗(yàn)表明cPFKFB4上調(diào)增加PKM2亞型比例，下調(diào)增加PKM1亞型比例，且這一調(diào)控依賴于hnRNP G。
cPFKFB4增強(qiáng)胰腺癌細(xì)胞糖酵解
代謝檢測(cè)發(fā)現(xiàn)cPFKFB4顯著促進(jìn)乳酸生成、葡萄糖攝取和ATP產(chǎn)生，增強(qiáng)胰腺癌細(xì)胞的糖酵解水平。挽救實(shí)驗(yàn)證實(shí)這一效應(yīng)通過hnRNP G介導(dǎo)。
圖2 cPFKFB4通過PKM2促進(jìn)胰腺癌惡性進(jìn)展
cPFKFB4通過PKM2促進(jìn)胰腺癌惡性進(jìn)展
體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)證實(shí)cPFKFB4通過PKM2促進(jìn)胰腺癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)顯示cPFKFB4對(duì)腫瘤生長(zhǎng)的促進(jìn)作用可被PKM2敲低所逆轉(zhuǎn)。
研究結(jié)論與意義
該研究首次揭示了缺氧誘導(dǎo)的環(huán)狀RNA hsa_circ_0065394編碼新型蛋白cPFKFB4，通過調(diào)控hnRNP G/hnRNP A1復(fù)合物影響PKM選擇性剪接，進(jìn)而重編程葡萄糖代謝促進(jìn)胰腺癌進(jìn)展的分子機(jī)制。
這一發(fā)現(xiàn)不僅為理解缺氧微環(huán)境、葡萄糖代謝重編程與胰腺癌惡性進(jìn)展之間的交叉對(duì)話提供了新視角，也為胰腺癌的診斷和治療提供了潛在的生物標(biāo)志物和治療靶點(diǎn)。cPFKFB4作為環(huán)狀RNA編碼的新型功能蛋白，拓展了我們對(duì)非編碼RNA功能多樣性的認(rèn)識(shí)，為腫瘤代謝研究開辟了新方向。
該研究發(fā)表于《Molecular Cancer》雜志，為胰腺癌的精準(zhǔn)治療提供了新的理論基礎(chǔ)和實(shí)驗(yàn)依據(jù)，對(duì)改善胰腺癌患者預(yù)后具有重要的臨床意義。
參考資料
[1] A novel protein cPFKFB4 encoded by hsa_circ_0065394 strengthens PKM2-mediated glucose metabolic reprogramming to facilitate pancreatic cancer progression under hypoxia
摘要：研究發(fā)現(xiàn)缺氧誘導(dǎo)的環(huán)狀RNA hsa_circ_0065394編碼新型蛋白cPFKFB4強(qiáng)化糖酵解并驅(qū)動(dòng)腫瘤惡性進(jìn)展。
胰腺癌作為消化系統(tǒng)高度惡性的腫瘤，其五年生存率始終徘徊在10%左右，被稱為"癌中之王"。這種嚴(yán)峻的預(yù)后與腫瘤特有的缺氧微環(huán)境密切相關(guān)。在胰腺癌組織中，氧分壓可低至0-5.3 mmHg，遠(yuǎn)低于正常組織的9.3-92.7 mmHg。這種極度缺氧的狀態(tài)不僅幫助腫瘤細(xì)胞適應(yīng)惡劣環(huán)境，還驅(qū)動(dòng)了一系列惡性生物學(xué)行為，成為胰腺癌預(yù)后不良的獨(dú)立預(yù)測(cè)因素。
在缺氧微環(huán)境中，環(huán)狀RNA（circRNA）作為一類新型閉合環(huán)狀分子，通過反向剪接形成，其生物發(fā)生和功能與腫瘤缺氧微環(huán)境密切相關(guān)。研究表明，缺氧能誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生多種circRNA，這些分子幫助腫瘤細(xì)胞在缺氧條件下維持生存并促進(jìn)腫瘤進(jìn)展。然而，在胰腺癌中，缺氧相關(guān)circRNA編碼的蛋白質(zhì)功能仍不清楚。
研究人員將目光聚焦于PFKFB4基因——一個(gè)在糖代謝中發(fā)揮關(guān)鍵作用的酶。PFKFB4作為糖酵解分流酶，在果糖-2,6-二磷酸和果糖-6-磷酸的相互轉(zhuǎn)化中起核心作用，滿足腫瘤細(xì)胞的能量需求和氧化還原穩(wěn)態(tài)，從而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞在缺氧環(huán)境中的生存?；诖耍芯繄F(tuán)隊(duì)提出科學(xué)假設(shè)：源自PFKFB4基因的circRNA可能是驅(qū)動(dòng)胰腺癌細(xì)胞適應(yīng)缺氧微環(huán)境并持續(xù)惡性演進(jìn)的關(guān)鍵分子。
為驗(yàn)證這一假設(shè)，研究人員采用缺氧培養(yǎng)系統(tǒng)篩選胰腺癌中缺氧響應(yīng)的circRNA，通過生物信息學(xué)分析和RNA免疫沉淀研究hsa_circ_0065394的環(huán)化機(jī)制，利用qRT-PCR和原位雜交評(píng)估其在胰腺癌中的表達(dá)譜和臨床意義。雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)、質(zhì)譜分析和Western blotting鑒定出hsa_circ_0065394編碼的蛋白cPFKFB4。通過功能獲得和缺失實(shí)驗(yàn)在體內(nèi)外驗(yàn)證cPFKFB4的生物學(xué)功能。從機(jī)制上，通過質(zhì)譜分析、免疫共沉淀、免疫熒光、PKM剪接檢測(cè)、RNA免疫沉淀、Western blotting和挽救實(shí)驗(yàn)，探索cPFKFB4如何調(diào)節(jié)hnRNP G與hnRNP A1的相互作用以及PKM選擇性剪接的調(diào)控。
研究發(fā)現(xiàn)缺氧相關(guān)的hsa_circ_0065394在胰腺癌組織中顯著上調(diào)，且與腫瘤大小密切相關(guān)。其生物環(huán)化由hnRNP L和Alu重復(fù)序列介導(dǎo)。機(jī)制上，hsa_circ_0065394通過非帽依賴機(jī)制編碼一個(gè)94個(gè)氨基酸的蛋白cPFKFB4。cPFKFB4通過特異性結(jié)合hnRNP G破壞hnRNP G-hnRNP A1復(fù)合物，促進(jìn)hnRNP A1介導(dǎo)的PKM選擇性剪接，從而增加PKM2的表達(dá)，進(jìn)而增強(qiáng)胰腺癌細(xì)胞的糖酵解，加速缺氧條件下胰腺癌的增殖和轉(zhuǎn)移。
圖1 由hsa_circ_0065394編碼的新型蛋白cPFKFB4通過增強(qiáng)PKM2介導(dǎo)的葡萄糖代謝重編程，促進(jìn)胰腺癌在缺氧條件下的進(jìn)展
關(guān)鍵技術(shù)方法
研究采用臨床樣本隊(duì)列（44對(duì)胰腺癌及癌旁組織）和腫瘤組織芯片（70例胰腺癌和58例正常組織），通過缺氧培養(yǎng)系統(tǒng)（1% O2）模擬腫瘤微環(huán)境。利用RNA酶R和放線菌素D實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證circRNA特性，雙熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)檢測(cè)IRES活性，質(zhì)譜分析鑒定蛋白質(zhì)相互作用，體內(nèi)外功能實(shí)驗(yàn)包括CCK-8、Transwell、裸鼠成瘤等評(píng)估生物學(xué)表型，PKM剪接實(shí)驗(yàn)和代謝檢測(cè)分析分子機(jī)制。
hsa_circ_0065394在缺氧胰腺癌細(xì)胞中的鑒定與表征
研究人員首先在缺氧條件下篩選PFKFB4來(lái)源的circRNA，發(fā)現(xiàn)hsa_circ_0065394在缺氧胰腺癌細(xì)胞中表達(dá)最顯著。Sanger測(cè)序證實(shí)該circRNA是由PFKFB4基因外顯子2、3、4通過頭尾剪接形成的281nt環(huán)狀RNA。
實(shí)驗(yàn)證實(shí)hsa_circ_0065394對(duì)RNA酶R具有抗性，且半衰期長(zhǎng)于線性mRNA，在細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)中均有分布，表明其是缺氧胰腺癌細(xì)胞中豐富且穩(wěn)定表達(dá)的circRNA。
hsa_circ_0065394的生物發(fā)生機(jī)制
通過生物信息學(xué)分析，研究人員在hsa_circ_0065394側(cè)翼內(nèi)含子中發(fā)現(xiàn)了高反向互補(bǔ)性的Alu重復(fù)序列（AluYc和AluSx1）。缺失突變實(shí)驗(yàn)證明只有同時(shí)存在這兩個(gè)Alu元件才能顯著上調(diào)hsa_circ_0065394表達(dá)。進(jìn)一步篩選發(fā)現(xiàn)hnRNP L是hsa_circ_0065394生物發(fā)生的關(guān)鍵調(diào)控因子。RNA免疫沉淀實(shí)驗(yàn)證實(shí)hnRNP L結(jié)合到PFKFB4前體mRNA的特定位點(diǎn)，促進(jìn)側(cè)翼內(nèi)含子互補(bǔ)重復(fù)元件的結(jié)合，從而加速hsa_circ_0065394的環(huán)化。
hsa_circ_0065394的表達(dá)特征與臨床意義
在胰腺癌細(xì)胞系中，hsa_circ_0065394表達(dá)顯著上調(diào)，尤其在PANC-1和PL45細(xì)胞中。臨床樣本分析顯示其在胰腺癌組織中明顯高表達(dá)，且與腫瘤大小顯著相關(guān)。
組織芯片和原位雜交結(jié)果進(jìn)一步驗(yàn)證了hsa_circ_0065394在胰腺癌組織中的高表達(dá)。生存分析顯示高表達(dá)患者總生存期更差，表明其具有重要的臨床預(yù)后價(jià)值。
hsa_circ_0065394編碼新型蛋白cPFKFB4
生物信息學(xué)預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)hsa_circ_0065394包含一個(gè)285nt的開放閱讀框（ORF）和內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)（IRES）。實(shí)驗(yàn)證實(shí)該circRNA可翻譯產(chǎn)生約25kDa的蛋白，命名為cPFKFB4。
雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)證明IRES序列具有啟動(dòng)翻譯活性，且完整的IRES序列對(duì)cPFKFB4的翻譯至關(guān)重要。
cPFKFB4通過hnRNP G調(diào)控PKM選擇性剪接
質(zhì)譜分析和免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)cPFKFB4與hnRNP G特異性相互作用。進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)確定cPFKFB4結(jié)合hnRNP G的SRGY和C-RBD結(jié)構(gòu)域。
研究發(fā)現(xiàn)hnRNP G通過C-RBD結(jié)構(gòu)域直接結(jié)合hnRNP A1，而cPFKFB4通過競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合hnRNP G的C-RBD結(jié)構(gòu)域，破壞hnRNP G-hnRNP A1復(fù)合物形成，從而增強(qiáng)hnRNP A1與PKM前體mRNA的結(jié)合。
PKM剪接實(shí)驗(yàn)表明cPFKFB4上調(diào)增加PKM2亞型比例，下調(diào)增加PKM1亞型比例，且這一調(diào)控依賴于hnRNP G。
cPFKFB4增強(qiáng)胰腺癌細(xì)胞糖酵解
代謝檢測(cè)發(fā)現(xiàn)cPFKFB4顯著促進(jìn)乳酸生成、葡萄糖攝取和ATP產(chǎn)生，增強(qiáng)胰腺癌細(xì)胞的糖酵解水平。挽救實(shí)驗(yàn)證實(shí)這一效應(yīng)通過hnRNP G介導(dǎo)。
圖2 cPFKFB4通過PKM2促進(jìn)胰腺癌惡性進(jìn)展
cPFKFB4通過PKM2促進(jìn)胰腺癌惡性進(jìn)展
體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)證實(shí)cPFKFB4通過PKM2促進(jìn)胰腺癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)顯示cPFKFB4對(duì)腫瘤生長(zhǎng)的促進(jìn)作用可被PKM2敲低所逆轉(zhuǎn)。
研究結(jié)論與意義
該研究首次揭示了缺氧誘導(dǎo)的環(huán)狀RNA hsa_circ_0065394編碼新型蛋白cPFKFB4，通過調(diào)控hnRNP G/hnRNP A1復(fù)合物影響PKM選擇性剪接，進(jìn)而重編程葡萄糖代謝促進(jìn)胰腺癌進(jìn)展的分子機(jī)制。
這一發(fā)現(xiàn)不僅為理解缺氧微環(huán)境、葡萄糖代謝重編程與胰腺癌惡性進(jìn)展之間的交叉對(duì)話提供了新視角，也為胰腺癌的診斷和治療提供了潛在的生物標(biāo)志物和治療靶點(diǎn)。cPFKFB4作為環(huán)狀RNA編碼的新型功能蛋白，拓展了我們對(duì)非編碼RNA功能多樣性的認(rèn)識(shí)，為腫瘤代謝研究開辟了新方向。
該研究發(fā)表于《Molecular Cancer》雜志，為胰腺癌的精準(zhǔn)治療提供了新的理論基礎(chǔ)和實(shí)驗(yàn)依據(jù)，對(duì)改善胰腺癌患者預(yù)后具有重要的臨床意義。
參考資料
[1] A novel protein cPFKFB4 encoded by hsa_circ_0065394 strengthens PKM2-mediated glucose metabolic reprogramming to facilitate pancreatic cancer progression under hypoxia
