摘要：研究針對膽管癌患者對多重酪氨酸激酶抑制劑蘇法替尼耐藥的關鍵機制。

膽管癌是一種起源于膽管上皮的高度惡性腫瘤，因其發(fā)病隱匿、進展迅速且治療手段有限，患者預后極差。盡管手術切除是目前唯一可能治愈的方法，但多數(shù)患者確診時已失去手術機會。傳統(tǒng)化療方案如吉西他濱聯(lián)合順鉑，雖然是一線標準治療，但療效有限，患者中位生存期難以令人滿意。近年來，靶向治療為膽管癌患者帶來了新的希望，特別是多重酪氨酸激酶抑制劑(mTKI)如蘇法替尼(surufatinib)在臨床應用中顯示出一定的潛力。然而，與許多靶向藥物一樣，耐藥性問題日益凸顯，相當一部分患者對mTKI治療無應答或很快產生耐藥，這成為臨床實踐中的主要挑戰(zhàn)。

深入研究膽管癌靶向治療耐藥機制，對于提高治療效果、延長患者生存期具有重要意義。以往研究多關注于腫瘤細胞內在的基因突變或表觀遺傳改變，而對腫瘤微環(huán)境在耐藥中的作用關注相對不足。尤其值得注意的是，胰島素樣生長因子1受體(IGF1R)信號通路在多種腫瘤中被證實參與耐藥形成，但在膽管癌中的具體作用機制尚不明確。同時，蛋白質酪氨酸磷酸酶(PTP)家族作為酪氨酸激酶的天然負調控因子，其在調節(jié)受體酪氨酸激酶(RTK)活性中的作用也值得深入探討。

 圖1 PTPN9通過去磷酸化IGF1R^Y1165/1166位點，緩解胰島素樣生長因子1受體介導的膽管癌對酪氨酸激酶抑制劑的耐藥性

發(fā)表在《Journal of Experimental & Clinical Cancer Research》上的這項研究，由山東大學齊魯醫(yī)院普通外科張志利教授團隊完成，系統(tǒng)闡述了PTPN9-IGF1R信號軸在膽管癌mTKI耐藥中的關鍵作用。研究人員通過臨床樣本分析、分子生物學實驗和動物模型驗證，揭示了腫瘤微環(huán)境中癌癥相關成纖維細胞(CAF)來源的IGF1通過激活IGF1R，進而導致對蘇法替尼的耐藥；而PTPN9作為重要的負調控因子，能夠逆轉這一過程。

為開展此項研究，研究人員采用了多項關鍵技術方法：利用免疫沉淀聯(lián)合質譜分析(IP-MS)篩選PTPN9的作用底物；通過晶體結構解析明確PTPN9與IGF1R的相互作用機制；建立正交小鼠模型進行體內藥效驗證；采用單細胞RNA測序技術分析腫瘤微環(huán)境中IGF1的來源；并通過組織微陣列(TMA)和免疫組化分析臨床樣本中PTPN9和IGF1R的表達與患者預后的關系。臨床樣本來源于山東大學齊魯醫(yī)院收治的膽管癌患者。

PTPN9-IGF1R介導TKI耐藥在膽管癌中的作用

研究人員首先比較了蘇法替尼應答與非應答膽管癌患者腫瘤組織中PTPN9的表達差異，發(fā)現(xiàn)非應答組PTPN9表達顯著降低，提示PTPN9可能與蘇法替尼耐藥相關。通過建立正交膽管癌小鼠模型，證實PTPN9過表達增強了對蘇法替尼的敏感性，而敲低PTPN9則導致耐藥。

進一步的機制探索中，研究人員通過IP-MS技術篩選出IGF1R是PTPN9的潛在新底物。TCGA數(shù)據(jù)庫分析顯示IGF1R在膽管癌組織中顯著高表達。體外實驗證實PTPN9與IGG1R存在直接相互作用，且在蘇法替尼應答患者組織中，PTPN9與IGF1R有明顯的共定位，而非應答組織中這種共定位顯著減少。

PTPN9相互作用并去磷酸化IGF1R^Y1165/1166在膽管癌中

生物信息學分析顯示，IGF1R磷酸化位點^Y1165/1166周圍序列與已知的PTPN9底物(如TrkA^Y674/675和FGFR2^Y656/657)具有高度同源性。酶動力學實驗證實了PTPN9與p-IGF1R^Y1165/1166之間的酶-底物關系。

功能實驗表明，敲低PTPN9增強了IGF1刺激的IGF1R^Y1165/1166磷酸化，促進細胞增殖、遷移和侵襲；而過表達PTPN9則產生相反效果。IGF1R的激活突變(^Y1165/1166E)增強而失活突變(^Y1165/1166F)減弱了這些惡性表型。動物實驗進一步證實，IGF1促進而IGF1R抑制劑林西替尼(linsitinib)抑制了腫瘤生長。

IGF1R旁路激活促進膽管癌中TKI耐藥

臨床樣本分析顯示，IGF1R在膽管癌組織中高表達，且與患者不良預后相關。通過逐步劑量遞增法建立的蘇法替尼耐藥細胞株(QBC-939/SR)顯示出對蘇法替尼的耐受性增強，同時伴有IGF1R^Y1165/1166磷酸化水平升高以及下游PI3K-Akt和MEK-Erk通路激活。

體內實驗表明，蘇法替尼與林西替尼聯(lián)合應用顯著抑制了腫瘤生長，效果優(yōu)于單藥治療。IGF1R過表達或^Y1165/1166激活突變減弱了蘇法替尼的抑瘤效果，而失活突變則增強了藥物敏感性，證實IGF1R磷酸化狀態(tài)是決定TKI敏感性的關鍵因素。

PTPN9識別和去磷酸化IGF1R^Y1165/1166的結構基礎

通過X射線晶體學分析，研究人員解析了PTPN9與p-IGF1R^Y1165/1166短肽復合物的晶體結構，分辨率達2.0埃。結構分析顯示，p-Y1166深入PTPN9催化中心，引起WPD環(huán)向內移動6.7埃，β3-β4環(huán)向外移動2.5埃，這些構象變化對酶活性至關重要。

Tyr333和Asp335是PTPN9-IGF1R相互作用的關鍵位點

酶動力學分析顯示，PTPN9對p-IGF1R^Y1165/1166具有較高的催化效率，尤其偏好Y1166位點。點突變實驗證實，Tyr333和Asp335是維持PTPN9催化活性的關鍵殘基，它們的突變顯著降低了酶活性。功能實驗表明，這些關鍵位點的突變削弱了PTPN9對IGF1R信號通路的負調控作用。

CAF來源的IGF1激活IGF1R并促進膽管癌進展

單細胞RNA測序分析顯示，成纖維細胞是腫瘤微環(huán)境中IGF1的主要來源。通過分離原代癌癥相關成纖維細胞(CAF)并檢測其條件培養(yǎng)基，證實CAF分泌高水平的IGF1。功能實驗表明，CAF條件培養(yǎng)基促進腫瘤細胞增殖、遷移和侵襲，而這一效應可被IGF1中和抗體或IGF1R敲低所逆轉。

動物實驗進一步驗證，與CAF共注射顯著促進腫瘤生長，而CAF中IGF1敲低或使用IGF1中和抗體則抑制腫瘤發(fā)展。IGF1R敲低的腫瘤細胞對CAF條件培養(yǎng)基的促瘤作用不敏感，而過表達IGF1R則增強這一效應。

討論與結論

本研究系統(tǒng)闡明了CAF來源的IGF1/PTPN9-IGF1R信號軸在膽管癌進展和TKI耐藥中的核心作用。研究發(fā)現(xiàn)不僅揭示了IGF1R作為膽管癌不良預后因子的臨床意義，還首次明確了PTPN9作為IGF1R磷酸酶的功能及其在調節(jié)TKI敏感性中的關鍵作用。

從機制角度看，本研究有多項重要發(fā)現(xiàn)：首先，通過結構生物學手段精確解析了PTPN9與IGF1R相互作用的分子基礎，鑒定出Tyr333和Asp335是關鍵催化殘基；其次，利用單細胞技術明確了CAF是腫瘤微環(huán)境中IGF1的主要來源，深化了對腫瘤-基質相互作用的理解；第三，通過體內外實驗證實了PTPN9下調是導致IGF1R信號異常激活的重要原因；最后，治療學實驗證明聯(lián)合應用IGF1R抑制劑林西替尼可有效逆轉蘇法替尼耐藥。

這些發(fā)現(xiàn)對膽管癌臨床實踐具有重要指導意義：一方面，PTPN9表達和IGF1R磷酸化狀態(tài)可作為預測mTKI療效的生物標志物，實現(xiàn)治療前患者分層；另一方面，蘇法替尼與林西替尼的聯(lián)合使用策略為克服耐藥提供了新思路?？紤]到林西替尼已在早期臨床試驗中顯示出可管理的安全性，這一聯(lián)合方案具有較好的臨床轉化前景。

值得注意的是，本研究也存在一定局限性，如僅使用單一耐藥細胞系可能無法涵蓋所有耐藥機制，以及林西替尼對胰島素受體(IR)的抑制可能帶來代謝副作用等。未來研究可探索新一代IGF1R選擇性降解劑，以提高靶向特異性并改善安全性。

總體而言，這項研究深化了對膽管癌靶向治療耐藥機制的理解，提出了基于生物標志物的精準治療策略，為改善膽管癌患者預后提供了新的思路和方法。通過同時靶向腫瘤細胞內在信號和微環(huán)境調控，有望實現(xiàn)更有效、更持久的治療效果。

[1] PTPN9 dephosphorylates IGF1R^Y1165/1166 and alleviates IGF1R-mediated resistance to tyrosine kinase inhibitor in cholangiocarcinoma