摘要：研究針對真核生物中N6-甲基腺嘌呤（6mA）的存在與功能爭議，通過牛津納米孔測序技術(shù)對18種單細(xì)胞真核生物進行堿基分辨率6mA分析。

在真核生物表觀遺傳學(xué)領(lǐng)域，DNA甲基化作為基因表達(dá)的關(guān)鍵調(diào)控機制一直備受關(guān)注。5-甲基胞嘧啶（5mC）作為最典型的DNA甲基化形式，其功能和機制已被廣泛研究。然而，另一種甲基化形式——N6-甲基腺嘌呤（6mA）在真核生物中的存在和功能卻長期存在爭議。許多相互矛盾的研究報告使得科學(xué)界對6mA在真核基因組中的真實作用莫衷一是。這種不確定性主要源于方法學(xué)上的局限性，特別是檢測技術(shù)可能帶來的假象。

盡管如此，一些單細(xì)胞真系，包括纖毛蟲、早期分支真菌和藻類衣藻，確實顯示出強烈的6mA信號，這引發(fā)了關(guān)于其起源和進化作用的疑問。為了解決這些爭議，由Alex de Mendoza領(lǐng)導(dǎo)的研究團隊在《Nature Genetics》上發(fā)表了突破性研究，通過先進的技術(shù)手段揭示了6mA在真核生物中的廣泛存在和進化意義。

 圖1 肥胖重塑脂肪組織中CD8+ T細(xì)胞的鐵代謝以加劇代謝性炎癥

研究人員應(yīng)用牛津納米孔測序技術(shù)，以堿基對分辨率分析了代表所有主要超群的18種單細(xì)胞真核生物的6mA模式。他們發(fā)現(xiàn)，強烈的6mA模式僅出現(xiàn)在編碼腺嘌呤甲基轉(zhuǎn)移酶AMT1的物種中。值得注意的是，6mA持續(xù)積累在轉(zhuǎn)錄起始位點下游，位于H3K4me3標(biāo)記的核小體之間，表明其與轉(zhuǎn)錄激活存在保守關(guān)聯(lián)。

研究團隊采用的主要技術(shù)方法包括：對231種真核生物基因組和轉(zhuǎn)錄組進行MT-A70甲基轉(zhuǎn)移酶系統(tǒng)發(fā)育分析；使用牛津納米孔R9.4.1和R10.4.1技術(shù)對18種真核生物進行全基因組DNA測序和修飾堿基識別；通過染色質(zhì)免疫沉淀測序（ChIP-seq）分析組蛋白修飾H3K4me3和H3K27ac的分布；利用RNA-seq進行基因表達(dá)分析；并對四種真核生物進行H3K4me3抑制劑處理實驗，以研究組蛋白修飾與6mA沉積的因果關(guān)系。

AMT1是祖先基因但在真核生物中反復(fù)丟失

為了闡明MT-A70甲基轉(zhuǎn)移酶的起源和進化，研究人員檢查了231個真核生物基因組和轉(zhuǎn)錄組。系統(tǒng)發(fā)育分析顯示，MT-A70家族包括六個已確立的真核生物家族：AMT1、AMT6/7、AMT2/5、METTL3、METTL14和METTL4。值得注意的是，原核生物序列形成了一個獨特的進化枝，表明MT-A70具有細(xì)菌起源，在真核生物進化早期被繼承。

研究發(fā)現(xiàn)，所有六個MT-A70家族都存在于大多數(shù)真核生物超群中，表明它們在最后真核生物共同祖先（LECA）之前已經(jīng)復(fù)制。RNA相關(guān)的METTL3和METTL14在整個物種系統(tǒng)發(fā)育中共同出現(xiàn)，模式類似于DNA相關(guān)的AMT1和AMT6/7，表明這兩種酶對在真核生物中具有保守的異源二聚體關(guān)聯(lián)。

6mA在編碼AMT1的物種中與轉(zhuǎn)錄相關(guān)

基于AMT1的分布，研究人員搜索了具有可檢測基因組6mA的真核生物譜系。為了避免細(xì)菌污染，他們專注于無菌培養(yǎng)的物種。研究選擇包括15個編碼AMT1的物種和3個缺乏AMT1直系同源物作為陰性對照的物種。

在所有編碼AMT1的物種中，AT是主要的甲基化背景，盡管AA也顯示出明顯的甲基化水平。ApT位點在所有編碼AMT1的物種中顯示對稱甲基化。相比之下，缺乏AMT1的物種在二核苷酸背景中的差異可忽略不計，AA二核苷酸富集程度最高。

研究人員隨后檢查了6mA的基因組分布。在缺乏AMT1的物種中，6mA在基因和轉(zhuǎn)座子（TE）中均勻出現(xiàn)，與背景噪聲一致。相反，在編碼AMT1的物種中，AT甲基化峰值出現(xiàn)在轉(zhuǎn)錄起始位點（TSS）附近?；騼?nèi)6mA與基因轉(zhuǎn)錄活性相關(guān)。

階段特異性轉(zhuǎn)錄獨立于6mA發(fā)生

研究人員測試了6mA在轉(zhuǎn)錄變化時的可變性。他們選擇了變形蟲A. castellanii、真菌S. punctatus、魚孢菌C. fragrantissima和C. perkinsii，因為這些生物具有不同的細(xì)胞階段，可以在培養(yǎng)中分離。

所有物種在ApT和基因水平分辨率上呈現(xiàn)靜態(tài)的6mA甲基化組，大多數(shù)基因顯示最小的6mA差異。在N. gruberi中，使用R9納米孔化學(xué)稱為甲基化的644個基因，在23°C和30°C下顯示可比較的6mA水平，盡管使用了R10化學(xué)和不同的分析流程。當(dāng)計算階段間差異表達(dá)基因的總數(shù)，并將這些與沿基因體顯示>1% 6mApT水平變化的基因重疊時，研究人員觀察到數(shù)千個基因改變表達(dá)而沒有任何可檢測的6mA改變。

5mC和6mA在真核生物中標(biāo)記不同功能

由于5mC是真核生物中另一種廣泛的DNA甲基化形式，研究人員檢查了其與6mA在他們物種集中的關(guān)系。他們發(fā)現(xiàn)了多樣的情況——物種表現(xiàn)出不可檢測的5mC水平伴隨高6mA，而其他物種專門含有5mC。一些物種呈現(xiàn)兩種修飾，而盤基網(wǎng)柄菌（Dictyostelium discoideum）兩種都沒有。

研究人員發(fā)現(xiàn)，6mA的突變效應(yīng)在富集區(qū)域最為明顯，特別是在TSS后。在大多數(shù)物種中，6mA與ApT組成沒有明顯關(guān)聯(lián)。在一些物種中，甲基化基因比未甲基化基因具有更高的ApT密度，與5mC看到的模式相反。帶有H3K4me3的核小體與6mA共定位

研究結(jié)果與先前報告一致，表明6mA在核小體連接DNA中富集。在纖毛蟲中，刪除AMT1破壞了6mA模式，導(dǎo)致TSS周圍核小體定位更加分散。數(shù)據(jù)集中的大多數(shù)物種也顯示周期性6mA模式。

為了探究什么塑造了6mA模式及其與核小體的聯(lián)系，研究人員對兩個TSS相關(guān)和轉(zhuǎn)錄活性組蛋白標(biāo)記——組蛋白3賴氨酸4三甲基化（H3K4me3）和賴氨酸27乙酰化（H3K27ac）進行了染色質(zhì)免疫沉淀測序（ChIP-seq）。

兩個組蛋白標(biāo)記顯示預(yù)期的TSS后富集，峰值寬度小于1,000 bp。研究人員隨后按H3K4me3信號對基因進行分組，發(fā)現(xiàn)6mA與這種組蛋白標(biāo)記緊密重疊。相比之下，H3K4me3峰值之外的基因組區(qū)域在所有物種中具有顯著較低的6mA水平。

為了直接測試H3K4me3沉積是否影響6mA存在，研究人員用H3K4me3抑制劑處理A. castellanii。他們使用OICR-9429和Piribedil，這些抑制劑阻斷WDR5與組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶的相互作用。兩種抑制劑導(dǎo)致H3K4me3水平的劑量依賴性降低，而總H3水平不受影響。在最高抑制劑濃度下，研究人員分析了處理和DMSO對照樣品中的6mA甲基化組。此外，6mA水平在抑制劑和對照組之間顯示最小差異，無論是全局還是在H3K4me3峰值上，表明H3K4me3不直接決定這些物種中的6mA沉積。

這項研究證實了6mA在真核生物中的廣泛存在，并追蹤其起源至最后真核生物共同祖先（LECA）。廣泛的采樣支持了一個祖先的AMT1通路，與真核生物生命樹的有爭議的根位置無關(guān)。與5mC DNMTs通過獨立細(xì)菌轉(zhuǎn)移被LECA獲取不同，6mA MT-A70甲基轉(zhuǎn)移酶可能通過單一事件從細(xì)菌供體繼承。

研究證實牛津納米孔作為6mA檢測的可靠平臺，展示了在具有不同基因組組成的物種中強大且可重復(fù)的模式。長讀長堿基對分辨率圖譜避免了其他方法的缺陷。作為一個例子，在T. vaginalis中，基于抗體的下拉表明6mA在Maverick反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子中富集，其中短讀長映射偽像很常見。相比之下，納米孔數(shù)據(jù)在轉(zhuǎn)錄基因上顯示強烈的周期性6mA模式，而在TE中沒有富集，與其他真核生物的模式一致。

AMT1通路反復(fù)丟失的發(fā)現(xiàn)挑戰(zhàn)了關(guān)于DNA甲基化進化的假設(shè)。與DNMTs和RNA m6A METTL3/METTL14通路類似，6mA-AMT1通路在真核生物中經(jīng)常丟失。由于6mA沒有明顯的突變效應(yīng)，這些丟失可能反映了進化偶然性，6mA的作用被替代機制補償。這在現(xiàn)存真核生物中產(chǎn)生了6mA和5mC的不同組合。

因此，6mA與轉(zhuǎn)錄強烈相關(guān)，在高度表達(dá)基因中富集，但其動態(tài)性似乎有限。在數(shù)據(jù)集中的五個物種中，6mA在轉(zhuǎn)錄擾動下顯示微小變化。在另一個最近發(fā)表的例子中，真菌Phycomyces blakesleeanus和Mucor lusitanicus也顯示適度的6mA動態(tài)，盡管有處理特定的轉(zhuǎn)錄變化。類似地，纖毛蟲和M. lusitanicus中的AMT1敲除導(dǎo)致有限的轉(zhuǎn)錄變化，而發(fā)育轉(zhuǎn)錄變化很少改變5mC模式。

6mA在核小體定位中的功能仍不清楚，因為具有突變AMT1的纖毛蟲表現(xiàn)無序核小體，但通常仍然可行，主要在性繁殖中致命地受影響。考慮到H3K4me3作為TSS后標(biāo)記的廣泛存在，即使在缺乏6mA的物種中，后者可能非必需或容易在該區(qū)域被替代。值得注意的是，H3K4me3和H2A.Z通常與真核生物中的5mC反相關(guān)，因此H3K4me3-6mA聯(lián)系可能進一步促進染色質(zhì)區(qū)室化。

在魚孢菌中，p1 PHD域表明可能的H3K4me3識別。因此，H3K4me3-6mA之間的層次關(guān)系可能獨立進化，或者它們的共存可能僅僅反映轉(zhuǎn)錄的下游結(jié)果，而不是直接因果聯(lián)系。生物物理上，6mA被認(rèn)為降低雙鏈DNA穩(wěn)定性，這種效應(yīng)可能有利于高度表達(dá)基因起始處的轉(zhuǎn)錄。然而，要理解6mA作為表觀遺傳標(biāo)記的作用，識別潛在閱讀器是關(guān)鍵。類似地，盡管5mC使DNA變硬，但其在真核生物中的功能更依賴于相關(guān)閱讀器或抑制轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合，而不是內(nèi)在生物物理特性。

有趣的是，5mC主要保留在主要多細(xì)胞真核生物譜系（植物、動物和雙核菌）中，而AMT1-6mA通路在這些譜系中丟失。在植物和動物中，5mC進化為甲基化基因體，取代TSS后區(qū)域中的6mA，但這種替代不可能是6mA丟失的唯一原因。植物和動物的單細(xì)胞親屬具有與6mA共存的基因體5mC，表明6mA和5mC具有獨特作用，即使發(fā)現(xiàn)在相同區(qū)域。

總之，這些數(shù)據(jù)重塑了對6mA功能和進化的理解，強調(diào)6mA和5mC都是原始真核生物染色質(zhì)工具包的組成部分。盡管纖毛蟲引領(lǐng)了我們對真核生物中6mA的理解，它們 drastically 不尋常的基因組組織，具有小核和大核，以及MT-A70s的譜系特異性擴展，將受益于來自替代譜系的補充見解。通過將分類單元采樣擴展到具有規(guī)范基因組的易處理物種，這項工作為闡明6mA功能和理解為什么該通路在主要多細(xì)胞譜系中丟失奠定了基礎(chǔ)。

[1] Adenine DNA methylation associated with transcriptionally permissive chromatin is widespread across eukaryotes