摘要：研究首次揭示了人類造血干細(xì)胞（HSC）克隆在穩(wěn)態(tài)造血中具有穩(wěn)定且獨(dú)特的譜系貢獻(xiàn)模式。
在人體這個(gè)精密的生命機(jī)器中，每秒鐘都有數(shù)百萬血細(xì)胞被更新，這個(gè)過程由造血干細(xì)胞（HSC）持續(xù)不斷地分化補(bǔ)充來維持。然而，關(guān)于人類HSC在穩(wěn)態(tài)造血過程中如何貢獻(xiàn)不同血細(xì)胞譜系的問題，長期以來缺乏直接證據(jù)。以往的研究只能在單個(gè)時(shí)間點(diǎn)觀察HSC克隆的貢獻(xiàn)，且未能同時(shí)評(píng)估關(guān)鍵的紅系和血小板譜系。更重要的是，由于人類體內(nèi)存在5萬-20萬個(gè)活躍貢獻(xiàn)的HSC，追蹤單個(gè)HSC克隆的命運(yùn)變得異常困難。
隨著年齡增長，HSC會(huì)積累體細(xì)胞突變，其中一些突變?nèi)鏒NMT3A、TET2等能夠賦予克隆生長優(yōu)勢而不影響血細(xì)胞發(fā)育，這種現(xiàn)象稱為克隆性造血（CH）。這為研究者提供了一個(gè)獨(dú)特的機(jī)會(huì)——利用這些突變作為天然標(biāo)記來追溯擴(kuò)展HSC克隆的譜系貢獻(xiàn)。
在這項(xiàng)發(fā)表于《Nature Genetics》的研究中，Tetsuichi Yoshizato等科學(xué)家對93名健康老年人（24-91歲，多數(shù)≥70歲）的骨髓樣本進(jìn)行了深入分析。他們通過錯(cuò)誤校正靶向測序技術(shù)（ECTS）篩查了23個(gè)CH常見突變基因，在71名個(gè)體中鑒定出211個(gè)體細(xì)胞CH驅(qū)動(dòng)突變。隨后利用高靈敏度的微滴數(shù)字PCR（ddPCR）技術(shù)，對純化的HSC、各譜系祖細(xì)胞和成熟血細(xì)胞進(jìn)行突變檢測，追蹤了57個(gè)HSC來源克隆的譜系貢獻(xiàn)。
研究團(tuán)隊(duì)發(fā)現(xiàn)HSC克隆僅表現(xiàn)出三種穩(wěn)定的譜系貢獻(xiàn)模式：平衡貢獻(xiàn)全部五系血細(xì)胞（血小板、紅細(xì)胞、髓系細(xì)胞、B細(xì)胞和T細(xì)胞，稱為PEMBT模式）；貢獻(xiàn)所有髓系譜系但不貢獻(xiàn)或極少貢獻(xiàn)T細(xì)胞（PEMB模式）；以及僅貢獻(xiàn)髓系譜系（血小板、紅細(xì)胞和髓系細(xì)胞，稱為PEM模式）。值得注意的是，約44%的克隆表現(xiàn)為PEMB限制或偏倚，23%為PEM限制或偏倚，而僅有26%顯示平衡的多系貢獻(xiàn)。
圖1 譜系限制性干細(xì)胞對人類造血的穩(wěn)定克隆貢獻(xiàn)
為了探究這些譜系限制模式是否由CH驅(qū)動(dòng)突變引起，研究人員進(jìn)行了系統(tǒng)發(fā)育分析。通過單細(xì)胞衍生克隆的全基因組測序（WGS），他們重建了系統(tǒng)發(fā)育樹，發(fā)現(xiàn)PEM限制的克隆早在數(shù)十年前就已經(jīng)確立其命運(yùn)決定，且這些模式在不同CH驅(qū)動(dòng)突變（如DNMT3A、TET2、ASXL1等）中廣泛分布，表明譜系限制并非主要由特定驅(qū)動(dòng)突變決定。
特別有趣的是，研究發(fā)現(xiàn)DNMT3A突變的HSC克隆顯著富集于PEMBT模式，這可能是因?yàn)檫@些克隆通常在生命早期出現(xiàn)，當(dāng)時(shí)HSC仍能主動(dòng)補(bǔ)充長壽的T細(xì)胞。而隨著衰老，HSC逐漸失去T細(xì)胞再生能力，從而更多表現(xiàn)為PEMB或PEM模式。
為了確認(rèn)B細(xì)胞貢獻(xiàn)是否反映持續(xù)的B淋巴細(xì)胞生成而非長壽B細(xì)胞的持久存在，研究人員檢測了克隆來源的CD34+CD19+B祖細(xì)胞（pro-B細(xì)胞）。結(jié)果顯示，在有成熟B細(xì)胞貢獻(xiàn)的HSC克隆中，pro-B細(xì)胞也存在相似的突變細(xì)胞分?jǐn)?shù)（MCF），證明這是持續(xù)的B淋巴細(xì)胞生成過程。
更重要的是，移植實(shí)驗(yàn)證實(shí)了譜系限制是HSC內(nèi)在編程的特性。將來自同一供體的PEMB限制和PEM限制的HSC克隆移植到免疫缺陷NSG小鼠后，它們保持了與在人體內(nèi)相同的譜系貢獻(xiàn)模式——能夠貢獻(xiàn)B細(xì)胞的克隆在小鼠中仍產(chǎn)生B細(xì)胞，而不能貢獻(xiàn)B細(xì)胞的克隆在小鼠中也無法產(chǎn)生B細(xì)胞。
前瞻性分析顯示，這些HSC克隆的譜系貢獻(xiàn)模式在長達(dá)65個(gè)月的觀察期內(nèi)保持驚人穩(wěn)定，無論是平衡的多系貢獻(xiàn)還是譜系限制/偏倚的模式，都未隨時(shí)間發(fā)生顯著變化。
系統(tǒng)發(fā)育分析揭示了HSC克隆譜系貢獻(xiàn)的兩種演變模式："等級(jí)"模式，即后代亞克隆比祖先克隆表現(xiàn)出更高程度的譜系限制（從PEMBT向PEMB或PEMB向PEM演變）；和更常見的"穩(wěn)定"模式，即盡管與祖先克隆分離數(shù)十年，后代克隆仍顯示出高度一致的譜系貢獻(xiàn)模式。
本研究首次在人類中全面描繪了HSC克隆在穩(wěn)態(tài)造血中的譜系貢獻(xiàn)模式，揭示了HSC存在穩(wěn)定的內(nèi)在譜系限制程序。這一發(fā)現(xiàn)不僅深化了對人類造血發(fā)育和衰老的理解，也為血液系統(tǒng)疾病的起源和治療提供了重要啟示。特別是這些譜系限制的HSC可能作為基因組改變的儲(chǔ)存庫，是不同譜系歸屬血液系統(tǒng)惡性腫瘤的起源細(xì)胞。
研究采用的幾個(gè)關(guān)鍵技術(shù)方法包括：1）通過錯(cuò)誤校正靶向測序（ECTS）技術(shù)篩查骨髓樣本中的CH突變；2）利用流式細(xì)胞術(shù)分選純化HSC、各譜系祖細(xì)胞和成熟血細(xì)胞；3）采用微滴數(shù)字PCR（ddPCR）進(jìn)行高靈敏度突變定量檢測；4）對單細(xì)胞衍生克隆進(jìn)行全基因組測序（WGS）并重建系統(tǒng)發(fā)育樹；5）通過免疫缺陷NSG小鼠移植模型驗(yàn)證HSC的譜系貢獻(xiàn)能力。
A limited repertoire of HSC lineage replenishment patterns
研究人員通過追蹤57個(gè)HSC來源克隆的譜系貢獻(xiàn)，發(fā)現(xiàn)人類HSC僅表現(xiàn)出三種穩(wěn)定的譜系貢獻(xiàn)模式：PEMBT（平衡貢獻(xiàn)所有五系）、PEMB（貢獻(xiàn)髓系但不貢獻(xiàn)T細(xì)胞）和PEM（僅貢獻(xiàn)髓系）。這些模式在不同CH驅(qū)動(dòng)突變中廣泛分布，表明譜系限制并非主要由特定驅(qū)動(dòng)突變決定。
Phylogenetic analysis infers stable HSC lineage replenishment
系統(tǒng)發(fā)育分析顯示，PEM限制的克隆早在數(shù)十年前就已經(jīng)確立其命運(yùn)決定。研究發(fā)現(xiàn)HSC克隆的譜系貢獻(xiàn)模式在系統(tǒng)發(fā)育樹中保持穩(wěn)定，后代亞克隆即使經(jīng)過數(shù)十年進(jìn)化，仍保持與祖先克隆高度一致的譜系貢獻(xiàn)模式。
HSC clonal lineage restriction is intrinsically programmed
移植實(shí)驗(yàn)證實(shí)譜系限制是HSC內(nèi)在編程的特性。將來自同一供體的PEMB限制和PEM限制的HSC克隆移植到NSG小鼠后，它們保持了與在人體內(nèi)相同的譜系貢獻(xiàn)模式，證明這種限制不是由骨髓微環(huán)境等外在因素決定的。
Prospective analysis reveals stable HSC lineage replenishment
前瞻性分析顯示，22個(gè)HSC克隆家族的譜系貢獻(xiàn)模式在長達(dá)65個(gè)月的觀察期內(nèi)保持穩(wěn)定，無論是平衡的多系貢獻(xiàn)還是譜系限制/偏倚的模式都未隨時(shí)間發(fā)生顯著變化，證明了HSC克隆命運(yùn)決定的長期穩(wěn)定性。
圖2 追溯長效造血干細(xì)胞克隆的起源
該研究得出結(jié)論，人類HSC在穩(wěn)態(tài)造血中表現(xiàn)出穩(wěn)定且可預(yù)測的譜系貢獻(xiàn)模式，這些模式由HSC內(nèi)在程序決定，并在數(shù)十年間保持穩(wěn)定。除了能夠貢獻(xiàn)全部五系血細(xì)胞的多能HSC外，還存在譜系限制性的HSC群體，包括PEMB限制（貢獻(xiàn)髓系但不貢獻(xiàn)T細(xì)胞）和PEM限制（僅貢獻(xiàn)髓系）的HSC克隆。這些譜系限制模式并非主要由CH驅(qū)動(dòng)突變引起，而是反映了HSC固有的分化程序。
這一發(fā)現(xiàn)對理解造血生物學(xué)具有重要意義：首先，它揭示了人類HSC在穩(wěn)態(tài)造血中的功能異質(zhì)性，挑戰(zhàn)了傳統(tǒng)認(rèn)為所有HSC都具有同等多能性的觀點(diǎn)；其次，研究發(fā)現(xiàn)HSC的譜系貢獻(xiàn)模式在數(shù)十年間保持穩(wěn)定，說明HSC的分化命運(yùn)是預(yù)先編程的且具有長期記憶性；最后，這些譜系限制的HSC可能成為特定血液系統(tǒng)疾病的細(xì)胞起源，為預(yù)防和治療年齡相關(guān)血液疾病提供了新的思路。
研究還發(fā)現(xiàn)，隨著衰老進(jìn)程，能夠貢獻(xiàn)全部五系（包括T細(xì)胞）的HSC克隆逐漸減少，而譜系限制的HSC克隆增加，這可能是造血系統(tǒng)衰老的重要機(jī)制之一。值得注意的是，DNMT3A突變的HSC克隆更傾向于保持多系分化能力，這可能與它們通常在生命早期出現(xiàn)有關(guān)，當(dāng)時(shí)HSC仍能主動(dòng)補(bǔ)充長壽的T細(xì)胞池。
這些發(fā)現(xiàn)將促使科學(xué)界重新思考HSC的功能異質(zhì)性及其在健康和疾病中的作用，為靶向特定HSC群體的治療策略奠定基礎(chǔ)。
參考資料
[1] Stable clonal contribution of lineage-restricted stem cells to human hematopoiesis
摘要：研究首次揭示了人類造血干細(xì)胞（HSC）克隆在穩(wěn)態(tài)造血中具有穩(wěn)定且獨(dú)特的譜系貢獻(xiàn)模式。
在人體這個(gè)精密的生命機(jī)器中，每秒鐘都有數(shù)百萬血細(xì)胞被更新，這個(gè)過程由造血干細(xì)胞（HSC）持續(xù)不斷地分化補(bǔ)充來維持。然而，關(guān)于人類HSC在穩(wěn)態(tài)造血過程中如何貢獻(xiàn)不同血細(xì)胞譜系的問題，長期以來缺乏直接證據(jù)。以往的研究只能在單個(gè)時(shí)間點(diǎn)觀察HSC克隆的貢獻(xiàn)，且未能同時(shí)評(píng)估關(guān)鍵的紅系和血小板譜系。更重要的是，由于人類體內(nèi)存在5萬-20萬個(gè)活躍貢獻(xiàn)的HSC，追蹤單個(gè)HSC克隆的命運(yùn)變得異常困難。
隨著年齡增長，HSC會(huì)積累體細(xì)胞突變，其中一些突變?nèi)鏒NMT3A、TET2等能夠賦予克隆生長優(yōu)勢而不影響血細(xì)胞發(fā)育，這種現(xiàn)象稱為克隆性造血（CH）。這為研究者提供了一個(gè)獨(dú)特的機(jī)會(huì)——利用這些突變作為天然標(biāo)記來追溯擴(kuò)展HSC克隆的譜系貢獻(xiàn)。
在這項(xiàng)發(fā)表于《Nature Genetics》的研究中，Tetsuichi Yoshizato等科學(xué)家對93名健康老年人（24-91歲，多數(shù)≥70歲）的骨髓樣本進(jìn)行了深入分析。他們通過錯(cuò)誤校正靶向測序技術(shù)（ECTS）篩查了23個(gè)CH常見突變基因，在71名個(gè)體中鑒定出211個(gè)體細(xì)胞CH驅(qū)動(dòng)突變。隨后利用高靈敏度的微滴數(shù)字PCR（ddPCR）技術(shù)，對純化的HSC、各譜系祖細(xì)胞和成熟血細(xì)胞進(jìn)行突變檢測，追蹤了57個(gè)HSC來源克隆的譜系貢獻(xiàn)。
研究團(tuán)隊(duì)發(fā)現(xiàn)HSC克隆僅表現(xiàn)出三種穩(wěn)定的譜系貢獻(xiàn)模式：平衡貢獻(xiàn)全部五系血細(xì)胞（血小板、紅細(xì)胞、髓系細(xì)胞、B細(xì)胞和T細(xì)胞，稱為PEMBT模式）；貢獻(xiàn)所有髓系譜系但不貢獻(xiàn)或極少貢獻(xiàn)T細(xì)胞（PEMB模式）；以及僅貢獻(xiàn)髓系譜系（血小板、紅細(xì)胞和髓系細(xì)胞，稱為PEM模式）。值得注意的是，約44%的克隆表現(xiàn)為PEMB限制或偏倚，23%為PEM限制或偏倚，而僅有26%顯示平衡的多系貢獻(xiàn)。
圖1 譜系限制性干細(xì)胞對人類造血的穩(wěn)定克隆貢獻(xiàn)
為了探究這些譜系限制模式是否由CH驅(qū)動(dòng)突變引起，研究人員進(jìn)行了系統(tǒng)發(fā)育分析。通過單細(xì)胞衍生克隆的全基因組測序（WGS），他們重建了系統(tǒng)發(fā)育樹，發(fā)現(xiàn)PEM限制的克隆早在數(shù)十年前就已經(jīng)確立其命運(yùn)決定，且這些模式在不同CH驅(qū)動(dòng)突變（如DNMT3A、TET2、ASXL1等）中廣泛分布，表明譜系限制并非主要由特定驅(qū)動(dòng)突變決定。
特別有趣的是，研究發(fā)現(xiàn)DNMT3A突變的HSC克隆顯著富集于PEMBT模式，這可能是因?yàn)檫@些克隆通常在生命早期出現(xiàn)，當(dāng)時(shí)HSC仍能主動(dòng)補(bǔ)充長壽的T細(xì)胞。而隨著衰老，HSC逐漸失去T細(xì)胞再生能力，從而更多表現(xiàn)為PEMB或PEM模式。
為了確認(rèn)B細(xì)胞貢獻(xiàn)是否反映持續(xù)的B淋巴細(xì)胞生成而非長壽B細(xì)胞的持久存在，研究人員檢測了克隆來源的CD34+CD19+B祖細(xì)胞（pro-B細(xì)胞）。結(jié)果顯示，在有成熟B細(xì)胞貢獻(xiàn)的HSC克隆中，pro-B細(xì)胞也存在相似的突變細(xì)胞分?jǐn)?shù)（MCF），證明這是持續(xù)的B淋巴細(xì)胞生成過程。
更重要的是，移植實(shí)驗(yàn)證實(shí)了譜系限制是HSC內(nèi)在編程的特性。將來自同一供體的PEMB限制和PEM限制的HSC克隆移植到免疫缺陷NSG小鼠后，它們保持了與在人體內(nèi)相同的譜系貢獻(xiàn)模式——能夠貢獻(xiàn)B細(xì)胞的克隆在小鼠中仍產(chǎn)生B細(xì)胞，而不能貢獻(xiàn)B細(xì)胞的克隆在小鼠中也無法產(chǎn)生B細(xì)胞。
前瞻性分析顯示，這些HSC克隆的譜系貢獻(xiàn)模式在長達(dá)65個(gè)月的觀察期內(nèi)保持驚人穩(wěn)定，無論是平衡的多系貢獻(xiàn)還是譜系限制/偏倚的模式，都未隨時(shí)間發(fā)生顯著變化。
系統(tǒng)發(fā)育分析揭示了HSC克隆譜系貢獻(xiàn)的兩種演變模式："等級(jí)"模式，即后代亞克隆比祖先克隆表現(xiàn)出更高程度的譜系限制（從PEMBT向PEMB或PEMB向PEM演變）；和更常見的"穩(wěn)定"模式，即盡管與祖先克隆分離數(shù)十年，后代克隆仍顯示出高度一致的譜系貢獻(xiàn)模式。
本研究首次在人類中全面描繪了HSC克隆在穩(wěn)態(tài)造血中的譜系貢獻(xiàn)模式，揭示了HSC存在穩(wěn)定的內(nèi)在譜系限制程序。這一發(fā)現(xiàn)不僅深化了對人類造血發(fā)育和衰老的理解，也為血液系統(tǒng)疾病的起源和治療提供了重要啟示。特別是這些譜系限制的HSC可能作為基因組改變的儲(chǔ)存庫，是不同譜系歸屬血液系統(tǒng)惡性腫瘤的起源細(xì)胞。
研究采用的幾個(gè)關(guān)鍵技術(shù)方法包括：1）通過錯(cuò)誤校正靶向測序（ECTS）技術(shù)篩查骨髓樣本中的CH突變；2）利用流式細(xì)胞術(shù)分選純化HSC、各譜系祖細(xì)胞和成熟血細(xì)胞；3）采用微滴數(shù)字PCR（ddPCR）進(jìn)行高靈敏度突變定量檢測；4）對單細(xì)胞衍生克隆進(jìn)行全基因組測序（WGS）并重建系統(tǒng)發(fā)育樹；5）通過免疫缺陷NSG小鼠移植模型驗(yàn)證HSC的譜系貢獻(xiàn)能力。
A limited repertoire of HSC lineage replenishment patterns
研究人員通過追蹤57個(gè)HSC來源克隆的譜系貢獻(xiàn)，發(fā)現(xiàn)人類HSC僅表現(xiàn)出三種穩(wěn)定的譜系貢獻(xiàn)模式：PEMBT（平衡貢獻(xiàn)所有五系）、PEMB（貢獻(xiàn)髓系但不貢獻(xiàn)T細(xì)胞）和PEM（僅貢獻(xiàn)髓系）。這些模式在不同CH驅(qū)動(dòng)突變中廣泛分布，表明譜系限制并非主要由特定驅(qū)動(dòng)突變決定。
Phylogenetic analysis infers stable HSC lineage replenishment
系統(tǒng)發(fā)育分析顯示，PEM限制的克隆早在數(shù)十年前就已經(jīng)確立其命運(yùn)決定。研究發(fā)現(xiàn)HSC克隆的譜系貢獻(xiàn)模式在系統(tǒng)發(fā)育樹中保持穩(wěn)定，后代亞克隆即使經(jīng)過數(shù)十年進(jìn)化，仍保持與祖先克隆高度一致的譜系貢獻(xiàn)模式。
HSC clonal lineage restriction is intrinsically programmed
移植實(shí)驗(yàn)證實(shí)譜系限制是HSC內(nèi)在編程的特性。將來自同一供體的PEMB限制和PEM限制的HSC克隆移植到NSG小鼠后，它們保持了與在人體內(nèi)相同的譜系貢獻(xiàn)模式，證明這種限制不是由骨髓微環(huán)境等外在因素決定的。
Prospective analysis reveals stable HSC lineage replenishment
前瞻性分析顯示，22個(gè)HSC克隆家族的譜系貢獻(xiàn)模式在長達(dá)65個(gè)月的觀察期內(nèi)保持穩(wěn)定，無論是平衡的多系貢獻(xiàn)還是譜系限制/偏倚的模式都未隨時(shí)間發(fā)生顯著變化，證明了HSC克隆命運(yùn)決定的長期穩(wěn)定性。
圖2 追溯長效造血干細(xì)胞克隆的起源
該研究得出結(jié)論，人類HSC在穩(wěn)態(tài)造血中表現(xiàn)出穩(wěn)定且可預(yù)測的譜系貢獻(xiàn)模式，這些模式由HSC內(nèi)在程序決定，并在數(shù)十年間保持穩(wěn)定。除了能夠貢獻(xiàn)全部五系血細(xì)胞的多能HSC外，還存在譜系限制性的HSC群體，包括PEMB限制（貢獻(xiàn)髓系但不貢獻(xiàn)T細(xì)胞）和PEM限制（僅貢獻(xiàn)髓系）的HSC克隆。這些譜系限制模式并非主要由CH驅(qū)動(dòng)突變引起，而是反映了HSC固有的分化程序。
這一發(fā)現(xiàn)對理解造血生物學(xué)具有重要意義：首先，它揭示了人類HSC在穩(wěn)態(tài)造血中的功能異質(zhì)性，挑戰(zhàn)了傳統(tǒng)認(rèn)為所有HSC都具有同等多能性的觀點(diǎn)；其次，研究發(fā)現(xiàn)HSC的譜系貢獻(xiàn)模式在數(shù)十年間保持穩(wěn)定，說明HSC的分化命運(yùn)是預(yù)先編程的且具有長期記憶性；最后，這些譜系限制的HSC可能成為特定血液系統(tǒng)疾病的細(xì)胞起源，為預(yù)防和治療年齡相關(guān)血液疾病提供了新的思路。
研究還發(fā)現(xiàn)，隨著衰老進(jìn)程，能夠貢獻(xiàn)全部五系（包括T細(xì)胞）的HSC克隆逐漸減少，而譜系限制的HSC克隆增加，這可能是造血系統(tǒng)衰老的重要機(jī)制之一。值得注意的是，DNMT3A突變的HSC克隆更傾向于保持多系分化能力，這可能與它們通常在生命早期出現(xiàn)有關(guān)，當(dāng)時(shí)HSC仍能主動(dòng)補(bǔ)充長壽的T細(xì)胞池。
這些發(fā)現(xiàn)將促使科學(xué)界重新思考HSC的功能異質(zhì)性及其在健康和疾病中的作用，為靶向特定HSC群體的治療策略奠定基礎(chǔ)。
參考資料
[1] Stable clonal contribution of lineage-restricted stem cells to human hematopoiesis
