1.項目背景
摘自《總甲狀腺素檢測試劑注冊技術(shù)審查指導(dǎo)原則》
1.1甲狀腺素（T4）的介紹
甲狀腺素（T4），即3,5,3',5'-四碘甲腺原氨酸，分子量約為776.93道爾頓，是甲狀腺腺體分泌的主要激素，以游離形式釋放進(jìn)入血循環(huán)中，絕大多數(shù)（99%以上）與血漿中的蛋白質(zhì)結(jié)合，稱為結(jié)合態(tài)，還有極微量的T4未與血漿中的蛋白質(zhì)結(jié)合，稱為游離態(tài)。
雖然結(jié)合型的甲狀腺激素在血液中占了絕大多數(shù)，但真正發(fā)揮生理作用的仍然是游離的甲狀腺激素。它的主要功能有維持生長發(fā)育、促進(jìn)代謝、產(chǎn)生神經(jīng)系統(tǒng)及心血管效應(yīng)、影響長骨的生長和腦的發(fā)育，是下丘腦-垂體-甲狀腺激素調(diào)節(jié)系統(tǒng)的組成部分，具有調(diào)節(jié)機體代謝的作用。
總甲狀腺素（TT4）指血清中游離態(tài)與結(jié)合態(tài)甲狀腺素總和，TT4的檢測在臨床上作為甲狀腺功能異常的輔助診斷，不作為甲狀腺癌的輔助診斷。
1.2 臨床意義
1.2.1 TT4增高的臨床意義
TT4升高見于：①甲狀腺功能亢進(jìn)（包括原發(fā)性、繼發(fā)性甲亢以及自主功能結(jié)節(jié)、T4型甲亢）時，甲狀腺合成和分泌TT4增高；②新生兒一時性甲狀腺功能亢進(jìn)；③亞急性甲狀腺炎和無痛性甲狀腺炎（如慢性淋巴細(xì)胞性甲狀腺炎）；④大量服用甲狀腺素和動物甲狀腺；⑤口服避孕藥、雌激素、肝炎、遺傳性TBG增高、吸毒等均能使TT4增高；⑥TSH不適當(dāng)分泌綜合征時增高。
1.2.2 TT4降低的臨床意義
TT4降低見于：①甲狀腺功能減低時，TT4減低；②甲狀腺缺乏，或先天性發(fā)育不良，甲狀腺全切除后，血TT4缺乏；③各種非甲狀腺疾病，如各種肝病、肝硬化、肝昏迷、腎病、腎衰、心肌梗死、呼吸及消化系統(tǒng)的嚴(yán)重疾病、傳染病、創(chuàng)傷、燒傷、饑餓、蛋白營養(yǎng)不良、糖尿病等，均可導(dǎo)致低T3綜合征，病情嚴(yán)重者TT4亦降低。若TT4顯著降低，提示病情危重預(yù)后不良。病情緩解后TT4恢復(fù)正常。
FT4 是一種未結(jié)合的具有生物活性的形式，在總T4中僅占0.03%。絕大部分T4無活性，與血清蛋白結(jié)合，如甲狀腺結(jié)合球蛋白(75%)，前白蛋白(15%)，白蛋白(10%)。游離T4的檢測理論上不受結(jié)合蛋白濃度和結(jié)合力特性的影響，因此不需要額外進(jìn)行反映結(jié)合參數(shù)類項目的檢測(如T-uptake，TBG)。
因此游離甲狀腺素的測定是臨床常規(guī)診斷的重要指標(biāo)。當(dāng)懷疑甲狀腺功能紊亂時，常常
聯(lián)合檢測游離T4和TSH。FT4也適合于甲狀腺抑制治療的療效監(jiān)測多種方法可測定游離甲狀腺素水平。平衡透析法和超濾法直接測定fT3和fT4是標(biāo)化常規(guī)免疫檢測方法的參考測量程序，免疫程序一般用于常規(guī)診斷。
1.3小分子雙抗體夾心法
2024年公開專利CN117871874A《小分子物質(zhì)免疫檢測方法》對小分子夾心法的反應(yīng)原理做了詳細(xì)闡述，摘抄部分內(nèi)容如下。
本發(fā)明提出了一種小分子物質(zhì)免疫檢測方法，其特征在于，包括：（1）將含有小分子物質(zhì)的樣本、配體、第二抗體和表面活性劑進(jìn)行反應(yīng)，得到小分子物質(zhì)-配體-第二抗體三元復(fù)合物，且所述小分子物質(zhì)-配體-第二抗體三元復(fù)合物中小分子物質(zhì)誘導(dǎo)配體形成至少一個新的構(gòu)象表位，所述第二抗體可特異性結(jié)合所述至少一個新的構(gòu)象表位，所述表面活性劑可消除所述第二抗體與構(gòu)象未改變的配體之間的結(jié)合；（2）檢測所述小分子物質(zhì)-配體-第二抗體三元復(fù)合物。
樣本中的小分子物質(zhì)與配體發(fā)生特異性結(jié)合，得到小分子物質(zhì)-配體復(fù)合物，并且小分子物質(zhì)-配體復(fù)合物中小分子物質(zhì)誘導(dǎo)配體形成至少一個新的構(gòu)象表位。小分子物質(zhì)-配體復(fù)合物與第二抗體和表面活性劑反應(yīng)，第二抗體特異性地與形成新構(gòu)象表位的配體結(jié)合，同時也會與構(gòu)象未改變的配體產(chǎn)生弱結(jié)合。表面活性劑可消除第二抗體與構(gòu)象未改變的配體之間的結(jié)合，得到小分子物質(zhì)-配體-第二抗體三元復(fù)合物。通過檢測三元復(fù)合物，可以實現(xiàn)小分子物質(zhì)檢測。由此，采用雙抗體夾心法可以提高檢測準(zhǔn)確性和靈敏度，不同濃度梯度樣本檢測區(qū)分度高。同時，減少了篩選高特異性復(fù)合物抗體的難度，更有利于小分子物質(zhì)檢測試劑盒的大規(guī)模生產(chǎn)和檢測，應(yīng)用價值高。
2. 性能表現(xiàn)
針對TT4/FT4的檢測（夾心法），西寶生物推出2株抗體、1株抗原及1種解離劑。
具體性能如下（以下評估僅代表在西寶生物的工藝體系下的驗證，建議客戶根據(jù)自身工藝進(jìn)行更為詳細(xì)的驗證）。
2.1化學(xué)發(fā)光（AE）平臺
組合1（TT4）：T4抗體（貨號：EKY0325F）包被羧基磁珠+T4抗體（貨號：EKY0325G）標(biāo)記吖啶酯+總甲狀腺激素（TT4)解離液（發(fā)光專用）（貨號：DCH0209A）；
線性范圍：0.5ug/dL-25ug/dL；最低檢出限：0.5ug/dL。
組合1（FT4）：T4抗體（貨號：EKY0325F）包被羧基磁珠+T4抗體（貨號：EKY0325G）標(biāo)記吖啶酯；
線性范圍：0.1ng/dL-7ng/dL；最低檢出限：0.1ng/dL。
2.2化學(xué)發(fā)光（AP）平臺
組合2（TT4）：T4抗體（貨號：EKY0325F）包被羧基磁珠+T4（貨號：EKY0325G）標(biāo)記堿性磷酸酶+總甲狀腺激素（TT4)解離液（發(fā)光專用）（貨號：DCH0209A）；
線性范圍：0.5ug/dL-25ug/dL；最低檢出限：0.5ug/dL。
組合2（FT4）：T4抗體（貨號：EKY0325F）包被羧基磁珠+T4抗體（貨號：EKY0325G）標(biāo)記堿性磷酸酶；
線性范圍：0.1ng/dL-7ng/dL；最低檢出限：0.1ng/dL。
2.3穩(wěn)定性評估
2.3.1 各組分工作液穩(wěn)定性
采用Seebio品牌甲狀腺素（T4）結(jié)合物AE發(fā)光稀釋液（貨號：DCD0525A）分別將磁珠包被T4抗體濃縮液、吖啶酯標(biāo)記T4抗體濃縮液配置成工作液及Seebio品牌甲狀腺素（T4）AP酶標(biāo)記物稀釋液（貨號DCD0526A）將堿性磷酸酶標(biāo)記T4抗體濃縮液配置成工作液，分別進(jìn)行37℃熱穩(wěn)定性實驗。如表1所示：
a.磁珠包被T4抗體工作液單獨37℃熱加速7天與2℃-8℃儲存7天發(fā)光值平均變化在±10%以內(nèi)（不含S0），表明磁珠包被T4抗體工作液熱穩(wěn)定性良好；
b.吖啶酯標(biāo)記T4抗體工作液單獨37℃熱加速7天與2℃-8℃儲存7天發(fā)光值平均變化在±10%以內(nèi)（不含S0），表明吖啶酯標(biāo)記T4抗體工作液熱穩(wěn)定性較好；
c.堿性磷酸酶標(biāo)記T4抗體工作液單獨37℃熱加速7天與2℃-8℃儲存7天發(fā)光值平均變化在±20%以內(nèi)（不含S0），表明堿性磷酸酶標(biāo)記T4抗體工作液熱穩(wěn)定性較好。
表1 T4各組分工作液熱穩(wěn)定性7天數(shù)據(jù)
序號 | T4標(biāo)準(zhǔn)品稀釋濃度 μg/dL | 磁珠-包被T4抗體工作液37℃熱加速7天與2℃-8℃儲存7天發(fā)光值均值差異 | 吖啶酯標(biāo)記T4抗體工作液37℃熱加速7天與2℃-8℃儲存7天發(fā)光值均值差異 | 堿性磷酸酶標(biāo)記T4抗體工作液37℃熱加速7天與2℃-8℃儲存7天發(fā)光值均值差異 |
S0 | 0 | 0.4% | -3.6% | -1.6% |
S1 | 0.5 | -3.7% | -4.3% | -19.4% |
S2 | 5 | -0.8% | -0.1% | -16.4% |
S3 | 10 | 2.1% | -0.9% | -15.9% |
S4 | 20 | 5.5% | -3.2% | -15.4% |
S5 | 40 | 6.5% | -4.9% | -12.1% |
平均變化（不含S0） | 1.9% | -2.7% | -15.8% | |
2.3.2 T4標(biāo)準(zhǔn)品穩(wěn)定性
2.3.2.1 采用甲狀腺素（T4）標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液1（貨號：DCD0527A）含復(fù)合酶保護劑AFP（ACE0074A）或復(fù)合酶穩(wěn)定劑AES（ACE0070A）分別將T4標(biāo)準(zhǔn)品（貨號：DKY0346A）稀釋成5個梯度（液體型），進(jìn)行37℃熱穩(wěn)定性實驗。
a）T4標(biāo)準(zhǔn)品稀釋梯度（液體型）2-8℃熱加速7天與-20℃儲存7天發(fā)光值平均變化在±10%以內(nèi);
b）T4標(biāo)準(zhǔn)品稀釋梯度（液體型）37℃熱加速7天與-20℃儲存7天發(fā)光值平均變化在±10%以內(nèi);
c）T4標(biāo)準(zhǔn)品抗原稀釋梯度（液體型）37℃熱加速7天與2℃-8℃儲存7天發(fā)光值平均變化在±10%以內(nèi);表明T4標(biāo)準(zhǔn)品在稀釋梯度（液體型）穩(wěn)定性良好。
表2 T4標(biāo)準(zhǔn)品梯度（液體型）穩(wěn)定性數(shù)據(jù)-T4標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液1
序號 | T4標(biāo)準(zhǔn)品梯度μg/dL | T4標(biāo)準(zhǔn)品梯度（液體型）2-8℃ 7天與-20℃ 7天差異 | T4標(biāo)準(zhǔn)品梯度（液體型）37℃ 7天與-20℃ 7天差異 | T4標(biāo)準(zhǔn)品梯度（液體型）37℃ 7天與2℃-8℃ 7天差異 |
S0 | 0 | 4.5% | 5.7% | 3.4% |
S1 | 0.5 | -3.9% | -1.6% | 2.3% |
S2 | 5 | 9.7% | 5.2% | -4.1% |
S3 | 10 | -3.7% | 0.6% | 4.4% |
S4 | 20 | 3.1% | 8.6% | 5.3% |
S5 | 40 | 0.2% | 3.5% | 3.3% |
平均變化（不含S0） | 1.1% | 3.3% | 2.3% | |
2.3.2.2 采用甲狀腺素（T4）標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液2（貨號：DCD0527B）含復(fù)合酶保護劑AFP（ACE0074A）或蛋白保護劑AEP-HBC（ACL0012A）或復(fù)合酶穩(wěn)定劑AES（ACE0070A）分別將T4標(biāo)準(zhǔn)品（貨號：DKY0346A）稀釋成5個梯度（液體型），進(jìn)行37℃熱穩(wěn)定性實驗。
d）T4標(biāo)準(zhǔn)品稀釋梯度（液體型）2-8℃熱加速7天與-20℃儲存7天發(fā)光值平均變化在±10%以內(nèi);
e）T4標(biāo)準(zhǔn)品稀釋梯度（液體型）37℃熱加速7天與-20℃儲存7天發(fā)光值平均變化在±10%以內(nèi);
f）T4標(biāo)準(zhǔn)品抗原稀釋梯度（液體型）37℃熱加速7天與2℃-8℃儲存7天發(fā)光值平均變化在±10%以內(nèi);表明T4標(biāo)準(zhǔn)品在稀釋梯度（液體型）穩(wěn)定性良好。
表3 T4標(biāo)準(zhǔn)品梯度（液體型）穩(wěn)定性數(shù)據(jù)-T4標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液2
序號 | T4標(biāo)準(zhǔn)品梯度μg/dL | T4標(biāo)準(zhǔn)品梯度（液體型） 2-8℃ 7天與-20℃ 7天差異 | T4標(biāo)準(zhǔn)品梯度（液體型）37℃ 7天與 -20℃ 7天差異 | T4標(biāo)準(zhǔn)品梯度（液體型）37℃ 7天與 2℃-8℃ 7天差異 |
S0 | 0 | 4.5% | -4.9% | -9.0% |
S1 | 0.5 | -5.3% | -4.4% | -4.2% |
S2 | 5 | -1.5% | -0.6% | 1.0% |
S3 | 10 | 0.4% | -5.5% | -6.1% |
S4 | 20 | -0.7% | -5.4% | -4.7% |
S5 | 40 | -0.8% | -6.0% | -5.3% |
平均變化（不含S0） | -1.6% | -4.4% | -3.9% | |
2.3.3 酶解深水魚皮明膠與牛血清白蛋白臨床數(shù)據(jù)對比
a.采用酶解深水魚皮明膠（貨號：ACH0085J）配成發(fā)光稀釋液，用發(fā)光稀釋液分別將磁珠包被T4抗體濃縮液、吖啶酯標(biāo)記T4抗體濃縮液配置成工作液；
b.采用牛血清白蛋白（貨號：DCL0001T）配成發(fā)光稀釋液，用發(fā)光稀釋液分別將磁珠包被T4抗體濃縮液、吖啶酯標(biāo)記T4抗體濃縮液配置成工作液；
c.用a和b配成的工作液，分別測試TT4不同濃度的臨床樣本。如表4所示，兩種緩沖體系下臨床相關(guān)系數(shù)r均大于0.975，結(jié)果相當(dāng)。含酶解深水魚皮明膠緩沖體系測試的信噪比更優(yōu)。因此，在T4項目上，酶解深水魚皮明膠（貨號：ACH0085J）可替代牛血清白蛋白（貨號：DCL0001T）。
表4 酶解深水魚皮明膠與牛血清白蛋白臨床數(shù)據(jù)對比數(shù)據(jù)
序號 | TT4羅氏樣本 濃度值 ug/dL | 含酶解深水魚皮明膠 緩沖體系 | 含牛血清白蛋白 緩沖體系 |
發(fā)光值 | 發(fā)光值 | ||
1 | 1.43 | 48821 | 83958 |
4 | 1.85 | 77098 | 118731 |
8 | 2.40 | 148503 | 139248 |
9 | 3.40 | 221520 | 242465 |
12 | 4.37 | 398014 | 393013 |
15 | 5.83 | 594089 | 528993 |
18 | 6.96 | 775815 | 694465 |
22 | 7.57 | 766796 | 706264 |
26 | 8.52 | 987549 | 893024 |
30 | 9.76 | 1236330 | 1021238 |
32 | 10.10 | 1225415 | 1076131 |
33 | 11.50 | 1352271 | 1125118 |
37 | 14.60 | 1693892 | 1400102 |
40 | 15.60 | 1673493 | 1363475 |
43 | 16.90 | 1633366 | 1359156 |
44 | 17.40 | 1853622 | 1404460 |
45 | 18.50 | 1842468 | 1617591 |
50 | 20.80 | 2615908 | 2183121 |
51 | 22.90 | 2607963 | 2247072 |
臨床相關(guān)性r | / | 0.987 | 0.984 |
信噪比 | 16.01 | 53.42 | 26.76 |
3.臨床相關(guān)性
3.1化學(xué)發(fā)光（AE）平臺：
3.1.1 西寶生物發(fā)光（AE）平臺TT4抗體配對組合1與羅氏診斷的TT4試劑（電化學(xué)發(fā)光法）賦值的臨床樣本相關(guān)性R2＞0.95，相關(guān)性較好；
3.1.2西寶生物發(fā)光（AE）平臺FT4抗體配對組合1與羅氏診斷的FT4試劑（電化學(xué)發(fā)光法）賦值的臨床樣本相關(guān)性R2＞0.95，相關(guān)性良好。
3.2化學(xué)發(fā)光（AP）平臺：
3.2.1西寶生物發(fā)光（AP）平臺TT4抗體配對組合2與羅氏診斷的TT4試劑（電化學(xué)發(fā)光法）賦值的臨床樣本相關(guān)性R2＞0.95左右，相關(guān)性較好；
3.2.2西寶生物發(fā)光（AP）平臺FT4抗體配對組合2與羅氏診斷的FT4試劑（電化學(xué)發(fā)光法）賦值的臨床樣本相關(guān)性R2在0.94左右，相關(guān)性良好。
4. 測試方案
4.1化學(xué)發(fā)光（AE）平臺
4.1.1 TT4抗體配對組合1
樣本:樣品加樣量10ul；
試劑1：T4抗體（貨號：EKY0325F）包被-磁珠稀釋物，用量50ul/測試；
試劑2：T4抗體（貨號：EKY0325G）標(biāo)記-吖啶酯稀釋物，用量50ul/測試；
試劑3：總甲狀腺激素（TT4)解離液（發(fā)光專用）（貨號：DCH0209A）。
反應(yīng)條件：
第一步：10ul預(yù)稀釋樣本+50ul試劑1+50ul 試劑2+50ul試劑3，37℃孵育10min，清洗；
第二步：加入預(yù)激發(fā)液及激發(fā)液，進(jìn)行測試。
4.1.2 FT4抗體配對組合1
樣本:樣品加樣量10ul；
試劑1：T4抗體（貨號：EKY0325F）包被-磁珠稀釋物，用量50ul/測試；
試劑2：T4抗體（貨號：EKY0325G）標(biāo)記-吖啶酯稀釋物，用量50ul/測試；
反應(yīng)條件：
第一步：10ul預(yù)稀釋樣本+50ul試劑1+50ul 試劑2，37℃孵育10min，清洗；
第二步：加入預(yù)激發(fā)液及激發(fā)液，進(jìn)行測試。
測試使用發(fā)光儀器:科斯邁SMART 500S。
4.2化學(xué)發(fā)光（AP）平臺
4.2.1 TT4抗體配對組合2：
樣本:樣品加樣量10ul；
試劑1：T4抗體（貨號：EKY0325F）包被-磁珠稀釋物，用量50ul/測試；
試劑2：T4抗體（貨號：EKY0325G）標(biāo)記-堿性磷酸酶稀釋物，用量50ul/測試；
試劑3：總甲狀腺激素（TT4)解離液（發(fā)光專用）（貨號：DCH0209A）。
反應(yīng)條件：
第一步：10ul預(yù)稀釋樣本+50ul試劑1+50ul 試劑2+50ul試劑3，37℃孵育10min，清洗；
第二步：加入底物，進(jìn)行測試。
4.2.2 FT4抗體配對組合2：
樣本:樣品加樣量10ul；
試劑1：T4抗體（貨號：EKY0325F）包被-磁珠稀釋物，用量50ul/測試；
試劑2：T4抗體（貨號：EKY0325G）標(biāo)記-堿性磷酸酶稀釋物，用量50ul/測試；
反應(yīng)條件：
第一步：10ul預(yù)稀釋樣本+50ul試劑1+50ul試劑2混合，37℃孵育10min，清洗；
第二步：加入底物，進(jìn)行測試。
測試使用發(fā)光儀器:迎凱Shine i2900。
5.產(chǎn)品信息
產(chǎn)品名稱 | 貨號 | 推薦配對 |
甲狀腺素（T4）抗體 | EKY0325F | TT4配對： T4抗體（貨號：EKY0325F）包被羧基磁珠+T4抗體（貨號：EKY0325G）標(biāo)記吖啶酯+TT4解離劑（發(fā)光專用）（貨號：DCH0208A）（發(fā)光配對組合1） T4抗體（貨號：EKY0325F）包被羧基磁珠+T4單抗（貨號：EKY0325G）標(biāo)記堿性磷酸酶+TT3/TT4解離劑（發(fā)光專用）（貨號：DCH0208A）（發(fā)光配對組合2） |
甲狀腺素（T4）抗體 | EKY0325G | |
甲狀腺素（T4）抗體 | EKY0325F | FT4配對： T4抗體（貨號：EKY0325F）包被羧基磁珠+T4抗體（貨號：EKY0325G）標(biāo)記吖啶酯（發(fā)光配對組合1） T4抗體（貨號：EKY0325F）包被羧基磁珠+T4抗體（貨號：EKY0325G）標(biāo)記堿性磷酸酶（發(fā)光配對組合2） |
甲狀腺素（T4）抗體 | EKY0325G | |
甲狀腺素（T4），標(biāo)準(zhǔn)品 | DKY0346A | |
T4抗體（貨號：EKY0325F）包被羧基磁珠濃縮液 | DKY1341A | |
T4抗體（貨號：EKY0325G）吖啶酯濃縮液 | DKY1342A | |
T4抗體（貨號：EKY0325G）標(biāo)記堿性磷酸酶濃縮液 | DKY1342B | |
AMPPD 發(fā)光底物液（即用型） | DCD0517A | |
AMPPD 發(fā)光底物液（即用型） | DCD0517B | |
羧基磁性微球，1.5um | DEG0800C | |
總甲狀腺激素（TT4)解離液（發(fā)光專用） | DCH0209A | |
酶解深水魚皮明膠 | ACH0085J | 磁珠及標(biāo)記物抗體稀釋液。建議使用濃度1%-10%。 |
牛血清白蛋白(無蛋白酶,低脂肪酸,低lgG,內(nèi)毒素) | DCL0001T-100g | 磁珠濃縮液、吖啶酯濃縮液、堿性磷酸酶濃縮液的稀釋液中及包被及標(biāo)記種封閉劑含有此款BSA可有效降低背景信號值及提高信噪比。建議使用濃度1%-2%。 |
DCL0001T-1Kg | ||
甲狀腺素（T4）AE發(fā)光稀釋液 | DCD0525A | |
甲狀腺素（T4）AP酶標(biāo)記物稀釋液 | DCD0526A | |
甲狀腺素（T4）標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液1 | DCD0527A | |
甲狀腺素（T4）標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液2 | DCD0527B | |
復(fù)合酶保護劑AFP | ACE0074A | 建議使用濃度5%左右。 |
蛋白保護劑AEP-HBC | ACL0012A | 建議使用濃度5%左右。 |
復(fù)合酶穩(wěn)定劑AES | ACE0070A | 建議使用濃度不高于4%。 |
1.項目背景
摘自《總甲狀腺素檢測試劑注冊技術(shù)審查指導(dǎo)原則》
1.1甲狀腺素（T4）的介紹
甲狀腺素（T4），即3,5,3',5'-四碘甲腺原氨酸，分子量約為776.93道爾頓，是甲狀腺腺體分泌的主要激素，以游離形式釋放進(jìn)入血循環(huán)中，絕大多數(shù)（99%以上）與血漿中的蛋白質(zhì)結(jié)合，稱為結(jié)合態(tài)，還有極微量的T4未與血漿中的蛋白質(zhì)結(jié)合，稱為游離態(tài)。
雖然結(jié)合型的甲狀腺激素在血液中占了絕大多數(shù)，但真正發(fā)揮生理作用的仍然是游離的甲狀腺激素。它的主要功能有維持生長發(fā)育、促進(jìn)代謝、產(chǎn)生神經(jīng)系統(tǒng)及心血管效應(yīng)、影響長骨的生長和腦的發(fā)育，是下丘腦-垂體-甲狀腺激素調(diào)節(jié)系統(tǒng)的組成部分，具有調(diào)節(jié)機體代謝的作用。
總甲狀腺素（TT4）指血清中游離態(tài)與結(jié)合態(tài)甲狀腺素總和，TT4的檢測在臨床上作為甲狀腺功能異常的輔助診斷，不作為甲狀腺癌的輔助診斷。
1.2 臨床意義
1.2.1 TT4增高的臨床意義
TT4升高見于：①甲狀腺功能亢進(jìn)（包括原發(fā)性、繼發(fā)性甲亢以及自主功能結(jié)節(jié)、T4型甲亢）時，甲狀腺合成和分泌TT4增高；②新生兒一時性甲狀腺功能亢進(jìn)；③亞急性甲狀腺炎和無痛性甲狀腺炎（如慢性淋巴細(xì)胞性甲狀腺炎）；④大量服用甲狀腺素和動物甲狀腺；⑤口服避孕藥、雌激素、肝炎、遺傳性TBG增高、吸毒等均能使TT4增高；⑥TSH不適當(dāng)分泌綜合征時增高。
1.2.2 TT4降低的臨床意義
TT4降低見于：①甲狀腺功能減低時，TT4減低；②甲狀腺缺乏，或先天性發(fā)育不良，甲狀腺全切除后，血TT4缺乏；③各種非甲狀腺疾病，如各種肝病、肝硬化、肝昏迷、腎病、腎衰、心肌梗死、呼吸及消化系統(tǒng)的嚴(yán)重疾病、傳染病、創(chuàng)傷、燒傷、饑餓、蛋白營養(yǎng)不良、糖尿病等，均可導(dǎo)致低T3綜合征，病情嚴(yán)重者TT4亦降低。若TT4顯著降低，提示病情危重預(yù)后不良。病情緩解后TT4恢復(fù)正常。
FT4 是一種未結(jié)合的具有生物活性的形式，在總T4中僅占0.03%。絕大部分T4無活性，與血清蛋白結(jié)合，如甲狀腺結(jié)合球蛋白(75%)，前白蛋白(15%)，白蛋白(10%)。游離T4的檢測理論上不受結(jié)合蛋白濃度和結(jié)合力特性的影響，因此不需要額外進(jìn)行反映結(jié)合參數(shù)類項目的檢測(如T-uptake，TBG)。
因此游離甲狀腺素的測定是臨床常規(guī)診斷的重要指標(biāo)。當(dāng)懷疑甲狀腺功能紊亂時，常常
聯(lián)合檢測游離T4和TSH。FT4也適合于甲狀腺抑制治療的療效監(jiān)測多種方法可測定游離甲狀腺素水平。平衡透析法和超濾法直接測定fT3和fT4是標(biāo)化常規(guī)免疫檢測方法的參考測量程序，免疫程序一般用于常規(guī)診斷。
1.3小分子雙抗體夾心法
2024年公開專利CN117871874A《小分子物質(zhì)免疫檢測方法》對小分子夾心法的反應(yīng)原理做了詳細(xì)闡述，摘抄部分內(nèi)容如下。
本發(fā)明提出了一種小分子物質(zhì)免疫檢測方法，其特征在于，包括：（1）將含有小分子物質(zhì)的樣本、配體、第二抗體和表面活性劑進(jìn)行反應(yīng)，得到小分子物質(zhì)-配體-第二抗體三元復(fù)合物，且所述小分子物質(zhì)-配體-第二抗體三元復(fù)合物中小分子物質(zhì)誘導(dǎo)配體形成至少一個新的構(gòu)象表位，所述第二抗體可特異性結(jié)合所述至少一個新的構(gòu)象表位，所述表面活性劑可消除所述第二抗體與構(gòu)象未改變的配體之間的結(jié)合；（2）檢測所述小分子物質(zhì)-配體-第二抗體三元復(fù)合物。
樣本中的小分子物質(zhì)與配體發(fā)生特異性結(jié)合，得到小分子物質(zhì)-配體復(fù)合物，并且小分子物質(zhì)-配體復(fù)合物中小分子物質(zhì)誘導(dǎo)配體形成至少一個新的構(gòu)象表位。小分子物質(zhì)-配體復(fù)合物與第二抗體和表面活性劑反應(yīng)，第二抗體特異性地與形成新構(gòu)象表位的配體結(jié)合，同時也會與構(gòu)象未改變的配體產(chǎn)生弱結(jié)合。表面活性劑可消除第二抗體與構(gòu)象未改變的配體之間的結(jié)合，得到小分子物質(zhì)-配體-第二抗體三元復(fù)合物。通過檢測三元復(fù)合物，可以實現(xiàn)小分子物質(zhì)檢測。由此，采用雙抗體夾心法可以提高檢測準(zhǔn)確性和靈敏度，不同濃度梯度樣本檢測區(qū)分度高。同時，減少了篩選高特異性復(fù)合物抗體的難度，更有利于小分子物質(zhì)檢測試劑盒的大規(guī)模生產(chǎn)和檢測，應(yīng)用價值高。
2. 性能表現(xiàn)
針對TT4/FT4的檢測（夾心法），西寶生物推出2株抗體、1株抗原及1種解離劑。
具體性能如下（以下評估僅代表在西寶生物的工藝體系下的驗證，建議客戶根據(jù)自身工藝進(jìn)行更為詳細(xì)的驗證）。
2.1化學(xué)發(fā)光（AE）平臺
組合1（TT4）：T4抗體（貨號：EKY0325F）包被羧基磁珠+T4抗體（貨號：EKY0325G）標(biāo)記吖啶酯+總甲狀腺激素（TT4)解離液（發(fā)光專用）（貨號：DCH0209A）；
線性范圍：0.5ug/dL-25ug/dL；最低檢出限：0.5ug/dL。
組合1（FT4）：T4抗體（貨號：EKY0325F）包被羧基磁珠+T4抗體（貨號：EKY0325G）標(biāo)記吖啶酯；
線性范圍：0.1ng/dL-7ng/dL；最低檢出限：0.1ng/dL。
2.2化學(xué)發(fā)光（AP）平臺
組合2（TT4）：T4抗體（貨號：EKY0325F）包被羧基磁珠+T4（貨號：EKY0325G）標(biāo)記堿性磷酸酶+總甲狀腺激素（TT4)解離液（發(fā)光專用）（貨號：DCH0209A）；
線性范圍：0.5ug/dL-25ug/dL；最低檢出限：0.5ug/dL。
組合2（FT4）：T4抗體（貨號：EKY0325F）包被羧基磁珠+T4抗體（貨號：EKY0325G）標(biāo)記堿性磷酸酶；
線性范圍：0.1ng/dL-7ng/dL；最低檢出限：0.1ng/dL。
2.3穩(wěn)定性評估
2.3.1 各組分工作液穩(wěn)定性
采用Seebio品牌甲狀腺素（T4）結(jié)合物AE發(fā)光稀釋液（貨號：DCD0525A）分別將磁珠包被T4抗體濃縮液、吖啶酯標(biāo)記T4抗體濃縮液配置成工作液及Seebio品牌甲狀腺素（T4）AP酶標(biāo)記物稀釋液（貨號DCD0526A）將堿性磷酸酶標(biāo)記T4抗體濃縮液配置成工作液，分別進(jìn)行37℃熱穩(wěn)定性實驗。如表1所示：
a.磁珠包被T4抗體工作液單獨37℃熱加速7天與2℃-8℃儲存7天發(fā)光值平均變化在±10%以內(nèi)（不含S0），表明磁珠包被T4抗體工作液熱穩(wěn)定性良好；
b.吖啶酯標(biāo)記T4抗體工作液單獨37℃熱加速7天與2℃-8℃儲存7天發(fā)光值平均變化在±10%以內(nèi)（不含S0），表明吖啶酯標(biāo)記T4抗體工作液熱穩(wěn)定性較好；
c.堿性磷酸酶標(biāo)記T4抗體工作液單獨37℃熱加速7天與2℃-8℃儲存7天發(fā)光值平均變化在±20%以內(nèi)（不含S0），表明堿性磷酸酶標(biāo)記T4抗體工作液熱穩(wěn)定性較好。
表1 T4各組分工作液熱穩(wěn)定性7天數(shù)據(jù)
序號 | T4標(biāo)準(zhǔn)品稀釋濃度 μg/dL | 磁珠-包被T4抗體工作液37℃熱加速7天與2℃-8℃儲存7天發(fā)光值均值差異 | 吖啶酯標(biāo)記T4抗體工作液37℃熱加速7天與2℃-8℃儲存7天發(fā)光值均值差異 | 堿性磷酸酶標(biāo)記T4抗體工作液37℃熱加速7天與2℃-8℃儲存7天發(fā)光值均值差異 |
S0 | 0 | 0.4% | -3.6% | -1.6% |
S1 | 0.5 | -3.7% | -4.3% | -19.4% |
S2 | 5 | -0.8% | -0.1% | -16.4% |
S3 | 10 | 2.1% | -0.9% | -15.9% |
S4 | 20 | 5.5% | -3.2% | -15.4% |
S5 | 40 | 6.5% | -4.9% | -12.1% |
平均變化（不含S0） | 1.9% | -2.7% | -15.8% | |
2.3.2 T4標(biāo)準(zhǔn)品穩(wěn)定性
2.3.2.1 采用甲狀腺素（T4）標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液1（貨號：DCD0527A）含復(fù)合酶保護劑AFP（ACE0074A）或復(fù)合酶穩(wěn)定劑AES（ACE0070A）分別將T4標(biāo)準(zhǔn)品（貨號：DKY0346A）稀釋成5個梯度（液體型），進(jìn)行37℃熱穩(wěn)定性實驗。
a）T4標(biāo)準(zhǔn)品稀釋梯度（液體型）2-8℃熱加速7天與-20℃儲存7天發(fā)光值平均變化在±10%以內(nèi);
b）T4標(biāo)準(zhǔn)品稀釋梯度（液體型）37℃熱加速7天與-20℃儲存7天發(fā)光值平均變化在±10%以內(nèi);
c）T4標(biāo)準(zhǔn)品抗原稀釋梯度（液體型）37℃熱加速7天與2℃-8℃儲存7天發(fā)光值平均變化在±10%以內(nèi);表明T4標(biāo)準(zhǔn)品在稀釋梯度（液體型）穩(wěn)定性良好。
表2 T4標(biāo)準(zhǔn)品梯度（液體型）穩(wěn)定性數(shù)據(jù)-T4標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液1
序號 | T4標(biāo)準(zhǔn)品梯度μg/dL | T4標(biāo)準(zhǔn)品梯度（液體型）2-8℃ 7天與-20℃ 7天差異 | T4標(biāo)準(zhǔn)品梯度（液體型）37℃ 7天與-20℃ 7天差異 | T4標(biāo)準(zhǔn)品梯度（液體型）37℃ 7天與2℃-8℃ 7天差異 |
S0 | 0 | 4.5% | 5.7% | 3.4% |
S1 | 0.5 | -3.9% | -1.6% | 2.3% |
S2 | 5 | 9.7% | 5.2% | -4.1% |
S3 | 10 | -3.7% | 0.6% | 4.4% |
S4 | 20 | 3.1% | 8.6% | 5.3% |
S5 | 40 | 0.2% | 3.5% | 3.3% |
平均變化（不含S0） | 1.1% | 3.3% | 2.3% | |
2.3.2.2 采用甲狀腺素（T4）標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液2（貨號：DCD0527B）含復(fù)合酶保護劑AFP（ACE0074A）或蛋白保護劑AEP-HBC（ACL0012A）或復(fù)合酶穩(wěn)定劑AES（ACE0070A）分別將T4標(biāo)準(zhǔn)品（貨號：DKY0346A）稀釋成5個梯度（液體型），進(jìn)行37℃熱穩(wěn)定性實驗。
d）T4標(biāo)準(zhǔn)品稀釋梯度（液體型）2-8℃熱加速7天與-20℃儲存7天發(fā)光值平均變化在±10%以內(nèi);
e）T4標(biāo)準(zhǔn)品稀釋梯度（液體型）37℃熱加速7天與-20℃儲存7天發(fā)光值平均變化在±10%以內(nèi);
f）T4標(biāo)準(zhǔn)品抗原稀釋梯度（液體型）37℃熱加速7天與2℃-8℃儲存7天發(fā)光值平均變化在±10%以內(nèi);表明T4標(biāo)準(zhǔn)品在稀釋梯度（液體型）穩(wěn)定性良好。
表3 T4標(biāo)準(zhǔn)品梯度（液體型）穩(wěn)定性數(shù)據(jù)-T4標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液2
序號 | T4標(biāo)準(zhǔn)品梯度μg/dL | T4標(biāo)準(zhǔn)品梯度（液體型） 2-8℃ 7天與-20℃ 7天差異 | T4標(biāo)準(zhǔn)品梯度（液體型）37℃ 7天與 -20℃ 7天差異 | T4標(biāo)準(zhǔn)品梯度（液體型）37℃ 7天與 2℃-8℃ 7天差異 |
S0 | 0 | 4.5% | -4.9% | -9.0% |
S1 | 0.5 | -5.3% | -4.4% | -4.2% |
S2 | 5 | -1.5% | -0.6% | 1.0% |
S3 | 10 | 0.4% | -5.5% | -6.1% |
S4 | 20 | -0.7% | -5.4% | -4.7% |
S5 | 40 | -0.8% | -6.0% | -5.3% |
平均變化（不含S0） | -1.6% | -4.4% | -3.9% | |
2.3.3 酶解深水魚皮明膠與牛血清白蛋白臨床數(shù)據(jù)對比
a.采用酶解深水魚皮明膠（貨號：ACH0085J）配成發(fā)光稀釋液，用發(fā)光稀釋液分別將磁珠包被T4抗體濃縮液、吖啶酯標(biāo)記T4抗體濃縮液配置成工作液；
b.采用牛血清白蛋白（貨號：DCL0001T）配成發(fā)光稀釋液，用發(fā)光稀釋液分別將磁珠包被T4抗體濃縮液、吖啶酯標(biāo)記T4抗體濃縮液配置成工作液；
c.用a和b配成的工作液，分別測試TT4不同濃度的臨床樣本。如表4所示，兩種緩沖體系下臨床相關(guān)系數(shù)r均大于0.975，結(jié)果相當(dāng)。含酶解深水魚皮明膠緩沖體系測試的信噪比更優(yōu)。因此，在T4項目上，酶解深水魚皮明膠（貨號：ACH0085J）可替代牛血清白蛋白（貨號：DCL0001T）。
表4 酶解深水魚皮明膠與牛血清白蛋白臨床數(shù)據(jù)對比數(shù)據(jù)
序號 | TT4羅氏樣本 濃度值 ug/dL | 含酶解深水魚皮明膠 緩沖體系 | 含牛血清白蛋白 緩沖體系 |
發(fā)光值 | 發(fā)光值 | ||
1 | 1.43 | 48821 | 83958 |
4 | 1.85 | 77098 | 118731 |
8 | 2.40 | 148503 | 139248 |
9 | 3.40 | 221520 | 242465 |
12 | 4.37 | 398014 | 393013 |
15 | 5.83 | 594089 | 528993 |
18 | 6.96 | 775815 | 694465 |
22 | 7.57 | 766796 | 706264 |
26 | 8.52 | 987549 | 893024 |
30 | 9.76 | 1236330 | 1021238 |
32 | 10.10 | 1225415 | 1076131 |
33 | 11.50 | 1352271 | 1125118 |
37 | 14.60 | 1693892 | 1400102 |
40 | 15.60 | 1673493 | 1363475 |
43 | 16.90 | 1633366 | 1359156 |
44 | 17.40 | 1853622 | 1404460 |
45 | 18.50 | 1842468 | 1617591 |
50 | 20.80 | 2615908 | 2183121 |
51 | 22.90 | 2607963 | 2247072 |
臨床相關(guān)性r | / | 0.987 | 0.984 |
信噪比 | 16.01 | 53.42 | 26.76 |
3.臨床相關(guān)性
3.1化學(xué)發(fā)光（AE）平臺：
3.1.1 西寶生物發(fā)光（AE）平臺TT4抗體配對組合1與羅氏診斷的TT4試劑（電化學(xué)發(fā)光法）賦值的臨床樣本相關(guān)性R2＞0.95，相關(guān)性較好；
3.1.2西寶生物發(fā)光（AE）平臺FT4抗體配對組合1與羅氏診斷的FT4試劑（電化學(xué)發(fā)光法）賦值的臨床樣本相關(guān)性R2＞0.95，相關(guān)性良好。
3.2化學(xué)發(fā)光（AP）平臺：
3.2.1西寶生物發(fā)光（AP）平臺TT4抗體配對組合2與羅氏診斷的TT4試劑（電化學(xué)發(fā)光法）賦值的臨床樣本相關(guān)性R2＞0.95左右，相關(guān)性較好；
3.2.2西寶生物發(fā)光（AP）平臺FT4抗體配對組合2與羅氏診斷的FT4試劑（電化學(xué)發(fā)光法）賦值的臨床樣本相關(guān)性R2在0.94左右，相關(guān)性良好。
4. 測試方案
4.1化學(xué)發(fā)光（AE）平臺
4.1.1 TT4抗體配對組合1
樣本:樣品加樣量10ul；
試劑1：T4抗體（貨號：EKY0325F）包被-磁珠稀釋物，用量50ul/測試；
試劑2：T4抗體（貨號：EKY0325G）標(biāo)記-吖啶酯稀釋物，用量50ul/測試；
試劑3：總甲狀腺激素（TT4)解離液（發(fā)光專用）（貨號：DCH0209A）。
反應(yīng)條件：
第一步：10ul預(yù)稀釋樣本+50ul試劑1+50ul 試劑2+50ul試劑3，37℃孵育10min，清洗；
第二步：加入預(yù)激發(fā)液及激發(fā)液，進(jìn)行測試。
4.1.2 FT4抗體配對組合1
樣本:樣品加樣量10ul；
試劑1：T4抗體（貨號：EKY0325F）包被-磁珠稀釋物，用量50ul/測試；
試劑2：T4抗體（貨號：EKY0325G）標(biāo)記-吖啶酯稀釋物，用量50ul/測試；
反應(yīng)條件：
第一步：10ul預(yù)稀釋樣本+50ul試劑1+50ul 試劑2，37℃孵育10min，清洗；
第二步：加入預(yù)激發(fā)液及激發(fā)液，進(jìn)行測試。
測試使用發(fā)光儀器:科斯邁SMART 500S。
4.2化學(xué)發(fā)光（AP）平臺
4.2.1 TT4抗體配對組合2：
樣本:樣品加樣量10ul；
試劑1：T4抗體（貨號：EKY0325F）包被-磁珠稀釋物，用量50ul/測試；
試劑2：T4抗體（貨號：EKY0325G）標(biāo)記-堿性磷酸酶稀釋物，用量50ul/測試；
試劑3：總甲狀腺激素（TT4)解離液（發(fā)光專用）（貨號：DCH0209A）。
反應(yīng)條件：
第一步：10ul預(yù)稀釋樣本+50ul試劑1+50ul 試劑2+50ul試劑3，37℃孵育10min，清洗；
第二步：加入底物，進(jìn)行測試。
4.2.2 FT4抗體配對組合2：
樣本:樣品加樣量10ul；
試劑1：T4抗體（貨號：EKY0325F）包被-磁珠稀釋物，用量50ul/測試；
試劑2：T4抗體（貨號：EKY0325G）標(biāo)記-堿性磷酸酶稀釋物，用量50ul/測試；
反應(yīng)條件：
第一步：10ul預(yù)稀釋樣本+50ul試劑1+50ul試劑2混合，37℃孵育10min，清洗；
第二步：加入底物，進(jìn)行測試。
測試使用發(fā)光儀器:迎凱Shine i2900。
5.產(chǎn)品信息
產(chǎn)品名稱 | 貨號 | 推薦配對 |
甲狀腺素（T4）抗體 | EKY0325F | TT4配對： T4抗體（貨號：EKY0325F）包被羧基磁珠+T4抗體（貨號：EKY0325G）標(biāo)記吖啶酯+TT4解離劑（發(fā)光專用）（貨號：DCH0208A）（發(fā)光配對組合1） T4抗體（貨號：EKY0325F）包被羧基磁珠+T4單抗（貨號：EKY0325G）標(biāo)記堿性磷酸酶+TT3/TT4解離劑（發(fā)光專用）（貨號：DCH0208A）（發(fā)光配對組合2） |
甲狀腺素（T4）抗體 | EKY0325G | |
甲狀腺素（T4）抗體 | EKY0325F | FT4配對： T4抗體（貨號：EKY0325F）包被羧基磁珠+T4抗體（貨號：EKY0325G）標(biāo)記吖啶酯（發(fā)光配對組合1） T4抗體（貨號：EKY0325F）包被羧基磁珠+T4抗體（貨號：EKY0325G）標(biāo)記堿性磷酸酶（發(fā)光配對組合2） |
甲狀腺素（T4）抗體 | EKY0325G | |
甲狀腺素（T4），標(biāo)準(zhǔn)品 | DKY0346A | |
T4抗體（貨號：EKY0325F）包被羧基磁珠濃縮液 | DKY1341A | |
T4抗體（貨號：EKY0325G）吖啶酯濃縮液 | DKY1342A | |
T4抗體（貨號：EKY0325G）標(biāo)記堿性磷酸酶濃縮液 | DKY1342B | |
AMPPD 發(fā)光底物液（即用型） | DCD0517A | |
AMPPD 發(fā)光底物液（即用型） | DCD0517B | |
羧基磁性微球，1.5um | DEG0800C | |
總甲狀腺激素（TT4)解離液（發(fā)光專用） | DCH0209A | |
酶解深水魚皮明膠 | ACH0085J | 磁珠及標(biāo)記物抗體稀釋液。建議使用濃度1%-10%。 |
牛血清白蛋白(無蛋白酶,低脂肪酸,低lgG,內(nèi)毒素) | DCL0001T-100g | 磁珠濃縮液、吖啶酯濃縮液、堿性磷酸酶濃縮液的稀釋液中及包被及標(biāo)記種封閉劑含有此款BSA可有效降低背景信號值及提高信噪比。建議使用濃度1%-2%。 |
DCL0001T-1Kg | ||
甲狀腺素（T4）AE發(fā)光稀釋液 | DCD0525A | |
甲狀腺素（T4）AP酶標(biāo)記物稀釋液 | DCD0526A | |
甲狀腺素（T4）標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液1 | DCD0527A | |
甲狀腺素（T4）標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液2 | DCD0527B | |
復(fù)合酶保護劑AFP | ACE0074A | 建議使用濃度5%左右。 |
蛋白保護劑AEP-HBC | ACL0012A | 建議使用濃度5%左右。 |
復(fù)合酶穩(wěn)定劑AES | ACE0070A | 建議使用濃度不高于4%。 |
