細(xì)胞因子除了自身在免疫效應(yīng)中有殺傷作用，也有著調(diào)控免疫細(xì)胞的關(guān)鍵作用，這也是實(shí)現(xiàn)免疫細(xì)胞體外大規(guī)模培養(yǎng)的重要基礎(chǔ)。

免疫細(xì)胞的信號(hào)通路，依賴細(xì)胞因子的刺激實(shí)現(xiàn)激活細(xì)胞，增殖和分化，對(duì)有些細(xì)胞（比如一些NK細(xì)胞）是維持活性的營(yíng)養(yǎng)所需。在免疫細(xì)胞療法的生產(chǎn)工藝中，應(yīng)用重組表達(dá)得到的細(xì)胞因子產(chǎn)品，對(duì)免疫細(xì)胞的培養(yǎng)而言，是不可或缺的關(guān)鍵原料。

對(duì)于通過(guò)多能誘導(dǎo)干細(xì)胞，獲得治療所需的免疫細(xì)胞，干細(xì)胞的誘導(dǎo)分化和培養(yǎng)擴(kuò)增，需要分階段逐次使用多種細(xì)胞因子。

 

在免疫細(xì)胞的培養(yǎng)中，有效使用多種細(xì)胞因子，可以產(chǎn)生疊加增強(qiáng)的調(diào)控作用。這也是在實(shí)踐中，兼顧細(xì)胞的擴(kuò)增規(guī)模、分化程度，以及活性療效和治療長(zhǎng)效性，獲得良好效果的實(shí)際策略。

IL-2又稱為T(mén)細(xì)胞生長(zhǎng)因子，是引起T細(xì)胞增殖最重要的細(xì)胞因子。IL-2通過(guò)與T細(xì)胞表面的IL-2受體（IL-2R）的特異性結(jié)合而促使T細(xì)胞活化，并進(jìn)入細(xì)胞分裂狀態(tài)。此外，IL-2還可刺激NK細(xì)胞的生長(zhǎng)并增強(qiáng)其殺傷能力。IL-2與其家族的其他T細(xì)胞生長(zhǎng)因子通過(guò)共用受體可活化和擴(kuò)增CD4+與CD8+ T細(xì)胞。

IL-2對(duì)T細(xì)胞和NK細(xì)胞的激活作用通過(guò)自分泌和旁分泌方式進(jìn)行。與T細(xì)胞不同，NK細(xì)胞不表達(dá)α受體亞單位，因此對(duì)IL-2親和力較低。但I(xiàn)L-2能促進(jìn)NK細(xì)胞增殖，增強(qiáng)細(xì)胞活性和其他細(xì)胞因子的分泌。B細(xì)胞也受IL-2激活、增殖和分化。

IL-7（白細(xì)胞介素 7 ）是 IL-2 相關(guān)細(xì)胞因子家族的一員，通過(guò)受體的γc（Gamma c）亞單位，刺激 T 細(xì)胞的存活、增殖與平衡。

IL-7 可替代 IL-2 用于 T 細(xì)胞活化，相對(duì)于IL-2，IL-7可大幅減輕對(duì)多個(gè)T細(xì)胞亞群的強(qiáng)烈刺激后的高度分化，減少了治療中的T細(xì)胞耗竭，并可避免 IL-2 對(duì) Treg 的激活引起的免疫耐受。有研究表明 IL-7 在注射疫苗或細(xì)胞治療中可擴(kuò)增抗原特異性 T 細(xì)胞；IL-7 也能夠促進(jìn)化療或造血干細(xì)胞移植后的 T 細(xì)胞恢復(fù)。

白細(xì)胞介素15（Interleukin-15，IL-15）是IL-2細(xì)胞因子家族成員之一，通過(guò)γ c（gamma c）受體亞單位發(fā)揮生物學(xué)功能。IL-2與IL-15都參與早期T細(xì)胞增殖與激活，IL-15的抗腫瘤活性還來(lái)源于通過(guò)非抗原特異性方式直接激活CD8+效應(yīng)T細(xì)胞。IL-15可對(duì)抗IL-2引起的細(xì)胞凋亡，并維持CD8+的記憶性T細(xì)胞，對(duì)維持長(zhǎng)時(shí)間抗腫瘤活性非常重要。

IL-15和IL-7在細(xì)胞培養(yǎng)中的使用，能顯著改善治療中的T細(xì)胞耗竭的情況發(fā)生，是培養(yǎng)工藝中的關(guān)鍵原料。

白細(xì)胞介素21（Interleukin-21, IL-21）屬于I類細(xì)胞因子，與IL-2、IL-4、IL-15等有較高的同源性，他們與IL-7，IL-9共用γ c (gamma c) 受體亞單位。體內(nèi)IL-21由活化的CD4+ T細(xì)胞產(chǎn)生，具有多種生物學(xué)效應(yīng)，刺激CD4+和CD8+ T細(xì)胞增殖，增強(qiáng)CD8+ T細(xì)胞和NK細(xì)胞毒性而不觸發(fā)激活誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡等。雖然IL-21在Th1/Th2分化中的作用機(jī)制尚未清楚，IL-21在體液免疫和天然免疫與獲得性免疫之間的轉(zhuǎn)換起到重要的調(diào)節(jié)作用。由于IL-21在增強(qiáng)體外抗原特異性T細(xì)胞增殖與分化中的重要功能，目前在免疫細(xì)胞治療中被越來(lái)越廣泛的應(yīng)用。

白細(xì)胞介素12（Interleukin-12, IL-12）是一種異源二聚體的細(xì)胞因子，具有多種免疫調(diào)節(jié)功能，主要由樹(shù)突狀細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、B淋巴細(xì)胞以及其他一些抗原遞呈細(xì)胞（APC）產(chǎn)生。IL-12只有一種單一的高親和力的受體，主要分布在激活的CD8+或CD4+ T細(xì)胞和CD56+ NK細(xì)胞的表面。IL-12能調(diào)節(jié)Th0細(xì)胞向Th1細(xì)胞分化，促進(jìn)Th1細(xì)胞的增殖，誘導(dǎo)NK細(xì)胞和T細(xì)胞產(chǎn)生IFN-gamma，提高NK細(xì)胞、LAK細(xì)胞的殺傷活性，促進(jìn)特異性CTL細(xì)胞的形成等，具有良好的抗腫瘤作用。

白細(xì)胞介素18（Interleukin-1, IL-18）屬I(mǎi)L-1家族，與IL-12相比具有更強(qiáng)的誘導(dǎo)產(chǎn)生IFN-gamma的能力。IL-18能刺激CD3單抗活化的T細(xì)胞增殖，也可作為NK細(xì)胞的激活劑，增強(qiáng)NK細(xì)胞的細(xì)胞毒性作用。此外，IL-18可與IL -12協(xié)同作用誘導(dǎo)產(chǎn)生IFN-gamma，提高NK細(xì)胞活性及促進(jìn)T細(xì)胞增殖

IFN-γ對(duì)巨噬細(xì)胞、T細(xì)胞、B細(xì)胞和NK細(xì)胞等均有一定作用。IFN-γ可上調(diào)外周血淋巴細(xì)胞表面IL-2R表達(dá)，從而增強(qiáng)T細(xì)胞對(duì)IL-2促增殖反應(yīng)的敏感度和強(qiáng)度。IFN-γ也會(huì)活化NK細(xì)胞，增強(qiáng)其細(xì)胞毒作用。

白細(xì)胞介素-4（IL-4）的生物作用包括刺激活化B細(xì)胞和T細(xì)胞增殖、CD4+ T細(xì)胞分化成II型輔助T細(xì)胞。DC培養(yǎng)中，IL-4和GM-CSF共同作用可使單核細(xì)胞定向分化為未成熟DC。

其他細(xì)胞因子蛋白，包括IL-6、TGF-β1、FLT3L等，對(duì)調(diào)控體內(nèi)T細(xì)胞、B細(xì)胞、NK細(xì)胞、DC細(xì)胞等免疫細(xì)胞的增殖、分化和成熟，起著重要的作用。

 

針對(duì)腫瘤疾病的CAR-T治療細(xì)胞中，CD4+T細(xì)胞和CD8+T細(xì)胞的比例一般接近1：1。CD4+T細(xì)胞主要分泌細(xì)胞因子，CD8+T細(xì)胞更多地產(chǎn)生直接殺傷腫瘤細(xì)胞的作用。

通過(guò)模擬樹(shù)突狀細(xì)胞在體外誘導(dǎo)CD3/CD28介導(dǎo)的T細(xì)胞活化，在細(xì)胞培養(yǎng)基中加入IL-2、IL-15、IL-7等因子，以維持CD8+T細(xì)胞的活化和擴(kuò)增。

針對(duì)自免疾病（紅斑狼瘡等）的CAR-T療法中，治療效用主要依靠Treg細(xì)胞，起到調(diào)控過(guò)度免疫的作用。通過(guò)給Treg裝上能特異性識(shí)別自身組織或移植物抗原的CAR，可以將其精準(zhǔn)招募到炎癥部位，局部、高效地抑制免疫攻擊，從而治療1型糖尿病、紅斑狼瘡、器官移植排斥等疾病。

 

NK細(xì)胞的完全活化、增殖、存活和效應(yīng)功能通常需要不同細(xì)胞因子的組合。正調(diào)節(jié)NK細(xì)胞功能的細(xì)胞因子包括IL-2、IL-15、IL-12、IL-18、IL-21和IFN-γ（主要由Th1細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和樹(shù)突狀細(xì)胞生成）。相反，細(xì)胞因子IL-4、IL-5和IL-10（由Th2細(xì)胞分泌）或者IL-1β、IL-6、IL-10、IL-23、IL-35和TGF-β（由腫瘤細(xì)胞分泌）可抑制NK細(xì)胞功能。

iPS細(xì)胞（ induced pluripotent stem cells，iPSCs ），也叫誘導(dǎo)多能干細(xì)胞。2006年，日本京都大學(xué)山中伸彌教授在 Cell 期刊發(fā)表論文，發(fā)現(xiàn)將 Oct3/4、Sox2、Klf4、c-Myc 這四種轉(zhuǎn)錄因子通過(guò)病毒載體導(dǎo)入成熟體細(xì)胞后，可將體細(xì)胞轉(zhuǎn)化為誘導(dǎo)多能干細(xì)胞（iPSC）。iPSC來(lái)源的細(xì)胞治療，有幾大優(yōu)勢(shì)。

iPSC作為細(xì)胞療法的原材料可提供大量細(xì)胞來(lái)源，能夠逾越供體細(xì)胞來(lái)源及細(xì)胞體外擴(kuò)增能力的限制。

iPSC的分化潛能使其通過(guò)篩選具有CAR表達(dá)的單個(gè)克隆，體外誘導(dǎo)分化為免疫細(xì)胞，可以免除大批量GMP級(jí)別的載體、病毒制備及質(zhì)控檢測(cè)工藝流程及步驟，降低成本并產(chǎn)出質(zhì)量均一的細(xì)胞產(chǎn)品。

iPSC結(jié)合目前發(fā)展極為迅速的基因編輯技術(shù)，將細(xì)胞上導(dǎo)致免疫排斥的基因敲除，可解決人體的免疫排斥反應(yīng)，產(chǎn)出可如一般藥品在大量生產(chǎn)后貯藏、隨時(shí)供患者使用的通用型免疫細(xì)胞治療產(chǎn)品，擴(kuò)大受益患者群體。

 

通過(guò)對(duì)iPSC的誘導(dǎo)分化，得到用于治療的T細(xì)胞，然后對(duì)從iPSC得到的T細(xì)胞改造，獲得CAR-T，大規(guī)模擴(kuò)增后得到治療用產(chǎn)品

根據(jù)目前比較成熟的培養(yǎng)方法，iPSC誘導(dǎo)分化的CAR-T大約需要30天的培養(yǎng)時(shí)間。細(xì)胞分化、激活并擴(kuò)增的過(guò)程，需根據(jù)培養(yǎng)階段加入不同的細(xì)胞因子組合，具體組合如上圖所示。

通過(guò)對(duì)iPSC的誘導(dǎo)分化，得到用于治療的NK細(xì)胞，然后對(duì)NK細(xì)胞改造，獲得CAR-NK，大規(guī)模擴(kuò)增后得到治療用產(chǎn)品

根據(jù)目前比較成熟的培養(yǎng)方法，iPSC誘導(dǎo)分化的CAR-NK需要一個(gè)多月的培養(yǎng)時(shí)間。細(xì)胞分化、激活并擴(kuò)增的過(guò)程，需根據(jù)培養(yǎng)階段加入不同的細(xì)胞因子組合，具體組合如上圖所示。