副流感病毒（parainfluenza viruses，HPIV）隸屬副黏病毒科（Paramyxoviridae），根據(jù)基因組特征及血清學(xué)特點，HPIV分為HPIV-1~4血清型，其中HPIV-1和HPIV-3為呼吸道病毒屬（Respirovirus），HPIV-2和HPIV-4為腮腺炎病毒屬（Rubulavirus）。HPIV在電鏡下多呈球形，直徑125~250nm，基因組約15500個核苷酸。其基因組可編碼6種結(jié)構(gòu)蛋白，如圖1所示，包括核蛋白NP蛋白（nucleoprotein，NP）、磷蛋白P蛋白（phosphoprotein，P）、基質(zhì)蛋白M蛋白（matrix protein，M）、血凝素-神經(jīng)氨酸酶蛋白HN蛋白（hemagglutinin-neuraminidase protein，HN）、融合蛋白F蛋白（fusion protein，F(xiàn)）和大蛋白L蛋白（large protein，L）。HN蛋白和F蛋白位于HPIV包膜表面，這2種蛋白是中和抗體的主要靶標(biāo)。M蛋白位于包膜內(nèi)層，HPIV包膜內(nèi)為核衣殼，NP蛋白包裹的基因組RNA作為轉(zhuǎn)錄的模板，L蛋白和P蛋白形成L-P RNA聚合酶復(fù)合體。P基因還編碼部分非結(jié)構(gòu)蛋白，這些蛋白在不同血清型間略有不同，HPIV-1 RNA編碼C蛋白，HPIV-2和HPIV-4 RNA 編碼V蛋白，HPIV-3 RNA編碼C蛋白和D蛋白，這些非結(jié)構(gòu)蛋白不是病毒復(fù)制的必需蛋白。HPIV感染宿主細(xì)胞時與宿主細(xì)胞膜融合，釋放核衣殼，L-P RNA聚合酶復(fù)合體識別模板進(jìn)行轉(zhuǎn)錄，經(jīng)核糖體翻譯為病毒結(jié)構(gòu)蛋白。病毒的子代RNA與NP蛋白組裝形成核衣殼，既可參與下一輪轉(zhuǎn)錄和翻譯，也可與結(jié)構(gòu)蛋白結(jié)合形成新的病毒顆粒釋放到細(xì)胞外。

圖1 HPIV全病毒結(jié)構(gòu)示意圖

HPIV主要侵犯呼吸道黏膜的表層組織，在纖毛上皮細(xì)胞內(nèi)復(fù)制和繁殖。感染多從鼻和口咽開始，2~5 d后可延伸至下呼吸道并達(dá)到復(fù)制高峰。HPIV常侵犯<5歲嬰幼兒的氣管、支氣管黏膜上皮細(xì)胞，引起細(xì)胞變性、壞死增生和黏膜糜爛。當(dāng)侵犯肺泡上皮細(xì)胞及間質(zhì)細(xì)胞時，則引起間質(zhì)性肺炎，或表現(xiàn)為支氣管炎或肺炎。HPIV-1和HPIV-2更易感染喉及氣管上段，與急性喉氣管支氣管炎有關(guān)。而HPIV-3感染遠(yuǎn)端氣道，與支氣管炎和肺炎相關(guān)。HPIV-4一般感染上呼吸道，通常癥狀輕。由于嬰幼兒免疫系統(tǒng)發(fā)育不完善，免疫應(yīng)答能力相對較弱，抗體持續(xù)時間較短，故易發(fā)生反復(fù)感染。疾病的嚴(yán)重程度取決于HPIV的感染部位、病毒載量、型別及宿主自身免疫等因素。

HPIV感染呈全球性分布，造成嚴(yán)重的疾病負(fù)擔(dān)，不同血清型在不同地區(qū)、不同年份的流行病學(xué)特征均有差異。HPIV是兒童呼吸道感染的主要病原體之一，中國疾控中心數(shù)據(jù)顯示，2009-2020年成人及兒童急性呼吸道感染患者病毒陽性率最高為流感病毒（28.5%），其次是呼吸道合胞病毒（16.8%）、鼻病毒（16.7%）和HPIV（13.1%）。HPIV檢出患者以5歲以下兒童多見，其中<2歲的兒童感染率最高。<5歲兒童中大約13%的急性呼吸道感染病例、4%~14%的急性下呼吸道感染住院病例和4%的急性下呼吸道感染死亡病例都?xì)w因于HPIV感染。HPIV感染主要以HPIV-1和HPIV-3為主，2011-2019年，美國HPIV陽性患者中各型別占比分別為18%（HPIV-1）、14%（HPIV-2）、55%（HPIV-3）和13%（HPIV-4），我國多項研究同樣證實HPIV-3是最主要的血清型。

實驗室檢測對于HPIV感染的臨床診治具有重要指導(dǎo)意義，目前實驗室常用的檢測手段包括病毒分離培養(yǎng)、抗原檢測、血清學(xué)抗體檢測、核酸檢測。不同檢測方法各有其優(yōu)勢和局限性，需要根據(jù)不同需求合理選擇應(yīng)用（表1）。

針對副流感病毒（HPIV1、2、3型）抗原的檢測，西寶生物推出5種單克隆抗體、3種抗原及1種菌液，適合膠體金免疫層析、彩色乳膠免疫層析及熒光免疫層析平臺。具體性能如下。

（以下評估僅代表在西寶生物的工藝體系下的驗證，建議客戶根據(jù)自身工藝進(jìn)行抗體交叉配對驗證）。

2.1.1 HPIV-1抗體配對組合：副流感病毒（HPIV）1&3型抗體（貨號：FKY0933D）標(biāo)記膠體金/彩色乳膠/熒光微球+副流感病毒（HPIV）1型抗體（貨號：FKY0933C）劃膜。

2.1.2 HPIV-2抗體配對組合：副流感病毒（HPIV）2型抗體（貨號：FKY0934C）標(biāo)記膠體金/彩色乳膠/熒光微球+副流感病毒（HPIV）2型抗體（貨號：FKY0934D）劃膜。

2.1.3 HPIV-3抗體配對組合：副流感病毒（HPIV）1&3型抗體（貨號：FKY0933D）標(biāo)記膠體金/彩色乳膠/熒光微球+副流感病毒（HPIV）3型抗體（貨號：FKY0935C）劃膜。

將HPIV-1抗原（貨號：EKY0221B）/HPIV-2抗原（貨號：EKY0221C）/HPIV-3抗原

（貨號：EKY0221D）分別用合適的稀釋液按照理論濃度依次稀釋到如下測試濃度。

2.3反應(yīng)模式：80uL樣品直接上樣，反應(yīng)時間15min-20min。

a.膠體金免疫層析平臺：采用HPIV-1抗體配對測試HPIV-1抗原稀釋梯度均顯色，靈敏度可達(dá)50ng/mL。該實驗結(jié)果表明此抗體配對在膠體金層析平臺測試性能良好。

b.彩色乳膠免疫層析平臺：采用HPIV-1抗體配對測試HPIV-1抗原稀釋梯度均顯色，靈敏度可達(dá)10ng/mL。該實驗結(jié)果表明此抗體配對在彩色乳膠層析平臺測試性能良好。

c.熒光免疫層析平臺：采用HPIV-1抗體配對測試HPIV-1抗原稀釋梯度均顯色，靈敏度可達(dá)5ng/mL。該實驗結(jié)果表明此抗體配對在熒光免疫層析平臺測試性能良好。

d.特異性：分別測試濃度為10ug/mL的腺病毒抗原、合胞病毒抗原、2019-nCOV-SRFc3cho抗原、2019-nCOV-SRHcho抗原、HPIV-2抗原、HPIV-3抗原，結(jié)果均為陰性，表明特異性良好。

圖1 膠體金層析平臺測試HPIV-1抗原梯度示意圖

圖2 彩色乳膠層析平臺測試HPIV-1抗原梯度示意圖

表1  HPIV-1抗體配對熒光層析平臺測試HPIV-1抗原梯度數(shù)據(jù)

a.在膠體金免疫層析平臺，采用HPIV-2抗體配對測試HPIV-2抗原稀釋梯度均顯色，靈敏度可達(dá)20ng/mL。該實驗結(jié)果表明此抗體配對在膠體金層析平臺測試性能良好。

b.在彩色乳膠免疫層析平臺，采用HPIV-2抗體配對測試HPIV-2抗原稀釋梯度均顯色，靈敏度可達(dá)1ng/mL。該實驗結(jié)果表明此抗體配對在彩色乳膠層析平臺測試性能良好。

測試陽性菌液可出線，與抗原梯度20ng/mL接近。

c.在熒光免疫層析平臺，采用HPIV-2抗體配對測試HPIV-2抗原稀釋梯度均顯色，靈敏度可達(dá)1ng/mL。該實驗結(jié)果表明此抗體配對在熒光免疫層析平臺測試性能良好。

測試陽性菌液熒光強度介于抗原梯度2ng/mL與5ng/mL之間。

d.特異性：分別測試濃度為10ug/mL的腺病毒抗原、合胞病毒抗原、2019-nCOV-SRFc3cho抗原、2019-nCOV-SRHcho抗原、HPIV-1抗原、HPIV-3抗原，結(jié)果均為陰性，表明特異性良好。

圖3 膠體金層析平臺測試HPIV-2抗原梯度示意圖

圖4 彩色乳膠層析平臺測試HPIV-2抗原梯度示意圖

圖5 彩色乳膠層析平臺測試HPIV-2抗原及菌液示意圖

表2  HPIV-2抗體配對熒光層析平臺測試HPIV-2抗原梯度數(shù)據(jù)

a.在膠體金免疫層析平臺，采用HPIV-3抗體配對測試HPIV-3抗原稀釋梯度均顯色，靈敏度可達(dá)10ng/mL。該實驗結(jié)果表明此抗體配對在膠體金層析平臺測試性能良好。

b.在彩色乳膠免疫層析平臺，采用HPIV-3抗體配對測試HPIV-3抗原稀釋梯度均顯色，靈敏度可達(dá)5ng/mL。該實驗結(jié)果表明此抗體配對在彩色乳膠層析平臺測試性能良好。

c.在熒光免疫層析平臺，采用HPIV-3抗體配對測試HPIV-3抗原稀釋梯度均顯色，靈敏度可達(dá)1ng/mL。該實驗結(jié)果表明此抗體配對在熒光免疫層析平臺測試性能良好。

d.特異性：分別測試濃度為10ug/mL的腺病毒抗原、合胞病毒抗原、2019-nCOV-SRFc3cho抗原、2019-nCOV-SRHcho抗原、HPIV-1抗原、HPIV-2抗原，結(jié)果均為陰性，表明特異性良好。

 

圖6 膠體金層析平臺測試HPIV-3抗原梯度示意圖

 

圖7 彩色乳膠層析平臺測試HPIV-3抗原梯度示意圖

表3  HPIV-3抗體配對熒光層析平臺測試HPIV-3抗原梯度數(shù)據(jù)

西寶生物作為體外診斷上游原料綜合供應(yīng)商，全方位助力IVD試劑盒開發(fā)，可為客戶提供呼吸道項目多指標(biāo)檢測原料，其他相關(guān)產(chǎn)品請參考

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